超声微波协同萃取枸杞黄酮的工艺研究

康慧芬，徐 建，李晓静，王佳文，杨惠琳，张立忠

(1.宁夏宝塔化工中心实验室(有限公司),宁夏 银川 750001； 2.宁夏宝塔石化科技实业发展有限公司,宁夏 银川 750001)

枸杞是传统的常用中药材，具有养肝明目、补血安神、润肺止咳、延缓衰老等功效[1]。有效化学成分主要包括色素类、多糖类和黄酮类化合物等[2]。黄酮类化合物是枸杞的重要活性成分，能改善血液循环、抗菌消炎、抗氧化、抗衰老、增强免疫力等，已作为天然色素、抗氧化剂、抗菌剂应用于食品工业、药物、化妆品等行业。由于其具有较强的药理作用与生物活性，已成为国内外关注和研究的热点[3]。本研究采用超声微波协同萃取法提取枸杞中的总黄酮。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

材料：枸杞(宁夏沃福百瑞生物食品工程有限公司)在60℃烘箱中烘干过夜，用粉碎机粉碎，混匀后待用。

标准品：芦丁标准品(中国药品生物制品检定所);

试剂：乙醇、氢氧化钠、硝酸铝、亚硝酸钠，均为分析纯。

1.2 主要仪器

超声微波协同萃取仪(上海新拓微波溶样测试技术有限公司); 电子天平(上海精密科学仪器有限公司); 紫外-可见分光光度计(德国耶拿仪器公司)等。

1.3 试验方法

1.3.1 标准溶液的制备

精密称量10.00mg干燥至恒重的芦丁标准品于100mL容量瓶中,加入70%乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀后备用。此标准溶液浓度为0.10mg/mL。

1.3.2 最大吸收波长的确定

精确量取10mL芦丁标准溶液于50mL容量瓶中,加入2mL 5%亚硝酸钠溶液,混匀后于室温放置6min；加入2mL 10%硝酸铝溶液,混匀后室温放置6min；再加入10mL 4%的氢氧化钠溶液,摇匀；最后用蒸馏水定容，摇匀后室温放置15min。用紫外-可见分光光度计在400～600nm间进行波谱扫描，确定最大吸收波长。

1.3.3 标准曲线的绘制

分别精确移取芦丁标准溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL于25mL容量瓶中,首先加入1mL 5%的亚硝酸钠溶液,混匀后于室温放置6min；然后加入1mL 10%的硝酸铝溶液,混匀后于室温放置6min；再加入5mL 4%的氢氧化钠溶液,摇匀；最后用蒸馏水定容,摇匀后静置15min。以不加样品的溶液为参比溶液，在最大吸收波长处测定吸光度,以标准溶液浓度(C)为横坐标，吸光度(A)为纵坐标绘制标准曲线。

1.3.4 样品的制备

精密称取1.00g枸杞粉末,加入一定量70%乙醇溶液，称重，在一定条件下超声-微波协同萃取后继续称重，补足损失重量，过滤得到滤液。精确量取该滤液1.0mL于25mL容量瓶，加入显色剂，定容摇匀静置后在最大吸收波长处测定吸光度,根据标准曲线方程计算提取液浓度，从而计算枸杞黄酮的提取率。

1.3.5 单因素试验

(1)提取温度考察试验。在提取液浓度为70%乙醇溶液 ,料液比为1∶25(g/mL)，提取时间为25min的条件下,依次在提取温度为30、40、50、60、70℃下进行提取,考察不同的提取温度对枸杞中黄酮提取率的影响。

(2)提取液浓度考察试验。在提取温度50℃，料液比1∶25(g/mL)，提取时间25min的条件下,依次在50%、60%、70%、80%、90%的乙醇浓度下进行提取, 考察不同提取液浓度对枸杞中黄酮提取率的影响。

(3)料液比考察试验。在提取温度50℃,提取液浓度为70%乙醇溶液,提取时间25min的条件下,依次在料液比为1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30下进行提取, 考察不同的提取料液比对枸杞中黄酮提取率的影响。(4)提取时间考察试验。在提取温度50℃,提取液浓度为70%乙醇溶液，料液比为1∶20(g/mL)的条件下,依次提取10、15、20、25、30min,考察不同提取时间对枸杞中黄酮提取率的影响。

1.3.6 正交实验

由于各影响因素之间具有交互作用，因此在单因素试验的基础上,根据已有资料和实际情况,对影响枸杞中黄酮提取率的4个因素,每个因素设计3个水平,进行L9(34)正交试验(见表1),以枸杞中黄酮的提取率为考察指标,选择最佳的提取条件。

表1 正交试验因素水平设计

2 结果与分析

2.1 最大波长的确定结果

由如图1可知，标准溶液在502nm处有最大吸收，因此选择502nm作为测定吸收波长。

2.2 标准曲线的制作

吸光度A对浓度C的标准曲线方程为:A=25.954C-0.0065，相关系数R2=0.9994。

2.3 单因素实验

(1)提取温度考察试验结果

图2 提取温度对枸杞黄酮提取率的影响

图2为提取液浓度70%的乙醇溶液，料液比1∶25(g/mL)、提取时间为25min的条件下，于不同提取温度下得到的提取率。由图可知,随着提取温度不断增加,枸杞黄酮的提取率也在逐渐增加。当提取温度达到50℃时,提取率增加缓慢,故综合提取率和能量消耗考虑，以提取温度为50℃为宜。

(2)乙醇浓度考察试验结果

图3 乙醇浓度对枸杞黄酮提取率的影响

图3为在提取温度为50℃，料液比为1∶25(g/mL)，提取时间25min的条件下,于不同乙醇浓度下测得到的枸杞黄酮提取率。由图可知,随着乙醇浓度的增加，黄酮提取率先随之增加，当乙醇浓度为70%时,提取率最高；之后随着乙醇浓度进一步增加,枸杞黄酮提取率随之降低。这可能是因为乙醇浓度不同，提取液的极性不同,而黄酮类化合物具有较高的极性,根据相似相溶的原理,当乙醇体积分数为70%时，对枸杞黄酮的溶解能力最强,因此选择70%乙醇溶液作为提取溶液。

(3) 料液比考察试验结果

图4为在提取温度50℃,提取液为70%乙醇溶液,提取时间25min的条件下,于不同料液比下测得到的枸杞黄酮提取率。由图4可以知道,随着料液比的增大,枸杞黄酮提取率也随之增大。这可能是因为料液比增大,枸杞粉末与提取液的接触面增大,而黄酮类化合物就更加容易渗透出来；当料液比增大到一定程度后,由于枸杞中黄酮含量有限,提取率的增加则趋于平缓。同时,液料比越大,提取液的用量就会增加,导致提取成本增加。因此,确定选择料液比为1∶20。

图4 料液比对枸杞黄酮提取率的影响

(4)提取时间考察试验结果

图5为提取温度50℃,提取液为70%乙醇溶液，料液比为1∶20(g/mL)的条件下,于不同提取时间测得到的提取率。由图5可知,随着提取时间不断增加,枸杞黄酮提取率也在逐渐增大。当提取时间达到20min时,随着时间的延长,提取率上升平缓,故综合提取率和能量消耗考虑，提取时间以20min为宜。

图5 提取时间对枸杞黄酮提取率的影响

2.4 正交试验及结果分析

由表2正交试验结果可以看出,各影响因素对枸杞黄酮提取率影响的先后顺序为:提取温度(A)>料液比(C) >乙醇浓度(B) >提取时间(D)。比较各因素的极差R值可以看出，提取温度(A)和料液比(C)的极差较大，说明这两个因素对枸杞黄酮提取率影响较为显著；而乙醇浓度(B) 和提取时间(D)的极差较小，说明这两个因素对枸杞黄酮提取率的影响较小。通过以上分析可以确定超声-微波协同萃取的最佳提取条件为A2B1C2D2,即提取温度50℃,料液比1∶20,提取液为60%乙醇溶液，提取时间20min。

表2 L9(34 )正交试验结果

2.5 验证试验

将筛选得到的最佳提取条件A2B1C2D2，即提取温度50℃, 提取液为60%乙醇溶液，料液比1∶20,提取时间20min,在此条件下重复实验3次,计算枸杞黄酮提取率。经试验验证(见表3),最佳提取条件下测得的三组枸杞黄酮平均提取率为1.98%，RSD为0.35%，重现性较好,本工艺条件合理。

表3 最佳工艺的验证结果

2.6 方法对比

将超声-微波协同萃取法与乙醇回流法[4]、超声波法[5]以及微波法[6]测得的枸杞黄酮提取率进行比较，结果见表4。由表可知,超声-微波协同萃取法与乙醇回流法和超声波法相比,提取时间缩短,提取率增加；与微波法相比，提取时间虽有少量增加，但提取率增加明显。由此可见,超声-微波协同萃取法是一种工艺简便、提取成本低、节约能源、提取率高的技术，可广泛应用于天然有效成分的提取。

表4 不同提取方法对枸杞黄酮提取率的影响

3 结论

(1)通过单因素试验和正交试验结果,确定了超声-微波协同萃取枸杞黄酮的最佳工艺条件为:提取温度50℃, 料液比为1∶20(g/mL),提取液为60%乙醇溶液,提取时间为20min,在此条件下枸杞黄酮提取率可达1.98%。

(2)超声-微波协同萃取法与乙醇回流法、超声波法和微波法相比提取时间短，能耗低，枸杞黄酮提取率大。该法简单快速、高效无污染,对枸杞的开发利用具有重要意义。

综上所述，超声-微波协同萃取枸杞黄酮是一种高效的提取技术，提取工艺操作简便，提取成本较低，节约能源，可以广泛应用于天然有效成分的提取，前景广阔。