3种秸秆腐熟剂微生物组成及其腐熟效果

孙 旭， 汝超杰， 苏良湖， 陈玉东， 赵克强， 张龙江， 蔡金傍

(1.南京大学生命科学学院，江苏南京 210023； 2.环境保护部南京环境科学研究所，江苏南京 210042； 3.河海大学环境学院，江苏南京 210098)

通信作者：蔡金傍，博士，副研究员，从事农村环境污染防治研究。E-mail：jinbangcai@126.com。

我国农作物秸秆的年产量在7亿t左右，利用率仅为78%，约2亿t秸秆随意堆放在田间地头或焚烧，造成了巨大的资源浪费和环境污染[1]。秸秆腐熟剂可加速秸秆中有机物的降解，发酵的有机肥施入农田中可增加土壤有机质含量，提高农作物抵御病害能力，加快农作物秸秆的资源化利用，减少秸秆焚烧带来的环境污染[2-3]。目前，我国生产秸秆腐熟剂的企业约有130余家，登记的腐熟剂产品有40个左右，而作为腐熟剂的菌种则达40种，涵盖细菌、真菌和放线菌[4]。经农业部土壤有机质提升补贴项目的实施，秸秆腐熟剂已有大量的应用，但存在腐熟剂种类多、菌种数量不足、菌种稳定性差、堆肥效果不理想的问题，不利于秸秆腐熟剂的推广与应用。以前对秸秆腐熟剂的研究大多集中在菌种筛选及腐熟性能方面，而对菌种组成与腐熟效果之间关系的研究较少[5-7]。针对秸秆腐熟剂在使用过程中存在的问题，本研究以3种秸秆腐熟菌剂为研究对象，考察秸秆腐熟菌剂的菌种组成以及对玉米秸秆的腐熟效果，为秸秆腐熟菌种筛选以及腐熟剂的推广提供理论基础和技术指导，具有一定的理论和应用价值。

1 材料与方法

1.1 试验材料

玉米秸秆和牛粪分别由南京六合勤丰秸秆有限公司和江苏镇江三明生物有限公司提供，基本性质见表1。秸秆腐熟剂为康源绿洲有机肥发酵菌剂、宜春堆肥腐熟剂、南华千牧EM菌剂，3种秸秆腐熟剂均为粉末状固体。

1.2 腐熟剂微生物组成分析

表1 玉米秸秆和牛粪的基本特性

秸秆腐熟剂微生物数量采用平板稀释法测定[8]。腐熟剂微生物组成采用高通量测序技术进行分析，按照Fast DNA试剂盒的操作说明提取腐熟剂基因组DNA，用引物338F/806R和817F/1 196R分别对细菌和真菌16S/18S rDNA基因进行PCR扩增[9]。将PCR产物纯化后送上海美吉公司进行Illumina Miseq测序，分别获得细菌、真菌16S/18S rDNA基因58 483、53 391条原始序列，去掉长度小于300 bp、含模糊碱基和引物碱基2个以上错配、单碱基重复超过6个的低质量序列后分别得到34 512、25 393条高质量序列，将获得的序列上传至核糖体数据库项目分类器[(RDP，ribosomal database project) classifier]，得到细菌和真菌的分类信息。本研究中Illumina Miseq测序获得的序列在NCBI Sequence Read Archive(SRA)上的登录号为SRX2010874。

1.3 堆肥试验

2015年8月4—30日在环保部南京环境科学研究所，将18.0 kg玉米秸秆和2.0 kg牛粪混匀，调节含水率为70%，C/N 约为29，平均分装到4个73 cm×53 cm×44 cm的180 L塑料整理箱中，设置1个对照(CK)和3个秸秆腐熟剂处理组，各腐熟剂分别以0.2%的量接入堆体进行25 d的秸秆腐熟试验，于腐熟后0、5、10、15、20、25 d取发酵物于-20 ℃下保存。

每天14：00用温度计监测堆体四周及中间区域30 cm深处的温度，取平均值作为堆体温度；取3 g堆肥样品，按照 1 ∶10 加入蒸馏水，充分振荡、离心后测定上清液pH值；将烘干至恒质量的样品在600 ℃马弗炉中灼烧3 h后称质量，计算挥发性固体物(VS)含量；采用CHN-O-Rapid元素分析仪测定堆肥样品的C/N；种子发芽指数(GI)参考竹江良的方法[10]进行测定。

1.4 数据分析

试验结果以“平均值±标准差”表示，采用SPSS 18.0软件进行数据方差分析(One-way ANOVA)检验处理间差异显著性，用Duncan’s法进行多重比较(P<0.05水平差异显著，P>0.05水平差异不显著)。

2 结果与分析

2.1 腐熟剂微生物组成

2.1.1 腐熟剂微生物数量 3种秸秆腐熟剂中活菌数为 3.33×1010～19.13×1010CFU/g(表2)，符合GB 20287—2006《农用微生物菌剂》的标准，细菌是优势微生物，约占活菌总数的 99.9%，南华腐熟剂中细菌数量可达19.13×1010CFU/g，分别是康源和宜春腐熟剂细菌数量的5.74、4.00倍。腐熟剂中真菌和放线菌数量占活菌总数的0.1%不到，其中康源腐熟剂真菌数量最多，宜春腐熟剂放线菌数量最多，而南华腐熟剂中真菌和放线菌数量最少(表2)。

表2 3种秸秆腐熟剂微生物数量

注：n=3；同列数据后不同的字母表示在0.05水平上差异显著。

2.1.2 腐熟剂微生物组成 为了解腐熟剂中微生物组成，采用高通量测序方法对腐熟剂中细菌和真菌种类进行分析，在97%相似度水平下分别将细菌、真菌序列统一测序深度至 8 000、6 000，细菌和真菌的分类信息如表3所示，3种秸秆腐熟剂中细菌和真菌种类存在明显差异，细菌序列可分为13门28纲54属，主要分布在厚壁菌门芽孢杆菌纲，相对丰度为90.5%～96.4%。康源腐熟剂主要以肠球菌(Enterococcus)为主，与屎肠球菌(Enterococcusfaecium)相似度达到99%；宜春腐熟剂则以芽孢杆菌(Bacillus)和侧孢芽孢杆菌(Brevibacillus)为主，南华腐熟剂以魏斯式菌(Weissella)和芽孢杆菌为主。真菌序列主要是子囊菌门酵母菌纲酵母菌(Saccharomyces)，与酿酒酵母(S.servazzii)相似度达到100%，相对丰度在80.62%～99.76%。

表3 3种腐熟剂微生物组成

2.2 腐熟剂腐熟效果

2.2.1 腐熟过程中的温度变化 温度是玉米秸秆腐熟程度的一个重要表征参数，不同腐熟剂对玉米秸秆腐熟温度的影响如图1所示，添加腐熟剂有助于提高玉米秸秆腐熟的最高温度以及延长高温阶段(>45 ℃)持续时间。不加腐熟剂的玉米秸秆最高腐熟温度为42 ℃，并未进入高温腐熟阶段。而添加康源、宜春、南华腐熟剂后，玉米秸秆的最高腐熟温度分别达到51、45、56 ℃，高温腐熟阶段分别维持在5、1、5 d。堆体温度在50 ℃以上保持5～7 d，是保证堆肥达到卫生学指标和腐熟的必要条件，添加康源和南华腐熟剂的堆肥均能满足堆肥卫生指标的要求，其中南华腐熟剂对玉米秸秆的高温降解更彻底。

2.2.2 腐熟过程中pH值的变化 pH值是影响微生物活性的主要因子之一。如图2所示，玉米秸秆腐熟过程中pH值呈现逐渐上升的趋势，腐熟初期上升最快，添加康源和南华腐熟剂的玉米秸秆pH值高于对照的pH值，而添加宜春腐熟剂的玉米秸秆pH值低于对照的pH值，可能是由于接种康源和南华腐熟剂加速了玉米秸秆的矿化，产生大量的NH3，从而导致pH值的增加。到25 d时各处理组的pH值在8.4～8.8之间，符合堆肥腐熟pH值在8.0～9.0的要求。

2.2.3 腐熟过程中挥发性固体物含量的变化 腐熟过程中挥发性固体物质的变化可以反映玉米秸秆中有机质的降解情况，结果如图3所示。添加腐熟剂处理堆肥的VS含量均低于对照处理，表明3种腐熟剂均能促进玉米秸秆有机质的降解。其中，康源和南华腐熟剂对玉米秸秆的降解效果较好，经过25 d的腐熟，VS含量分别减少到69.45%和69.14%。

2.2.4 腐熟过程中C/N的变化 玉米秸秆腐熟过程中C/N的变化如图4所示，添加腐熟剂处理组的C/N在腐熟后5 d已降至20以下，而对照组则需要15 d的时间；经25 d腐熟后，4个处理组C/N在13.43～14.22之间，且已完全腐熟。表明3种腐熟剂均能促进玉米秸秆腐熟，缩短达到腐熟的时间，3种腐熟剂对玉米秸秆腐熟过程中C/N没有明显影响。

2.2.5 腐熟过程中GI的变化 种子发芽指数(GI)常被用来测定堆肥的生物毒性，是表征堆肥腐熟水平的重要生物学指标之一。不同处理组的GI值呈先下降后上升的趋势(图5)，在腐熟后5 d时4个处理组GI值均低于70%，添加腐熟剂组GI值均低于对照组，这可能是由于接种腐熟剂后加快有机质的降解，产生了较多的有毒物质(氨和低级脂肪酸等)，抑制了水堇种子的发芽。在腐熟后15 d时添加腐熟剂组GI值均大于80%，而对照组GI值在腐熟后20 d才达到80%，经过25 d腐熟，4个处理组的GI值由高到低的顺序为南华>康源>宜春>对照，表明添加腐熟剂有助于降低秸秆腐熟发酵物植物毒性，加快堆肥腐熟进程。

3 讨论

秸秆腐熟剂的菌种组成通常决定了腐熟剂的腐熟效果，因此本研究随机选取3种秸秆腐熟菌剂，考察其菌种组成以及对玉米秸秆的腐熟效果。以前对秸秆腐熟剂成品的研究主要集中在腐熟特征及腐熟剂筛选上，而对菌种组成与腐熟效果之间关系的研究较少，尤其是采用高通量测序方法研究腐熟剂菌种组成还鲜有涉及[5-7，11-12]。本研究通过平板计数及焦磷酸测序得到的细菌(13门和54属)和真菌(1门和1属)分类结果显示，3种腐熟剂均由多种微生物菌种复合而成，以细菌为主、真菌和放线菌为辅，细菌的种类多于真菌，腐熟剂中有效活菌数量达到5.5×1010～19.1×1010CFU/g，与前人的研究结果[13]一致。与克隆文库相比，高通量测序方法能反映腐熟剂中更多的微生物信息，本研究中康源腐熟剂中肠球菌序列与屎肠球菌相似度达到99%，屎肠球菌虽然是一种发酵能力较强的菌株，但也是一种条件致病菌，存在潜在环境风险[12，14-15]。宜春和南华腐熟剂中细菌主要是芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、魏斯式菌，这些菌株对玉米和水稻秸秆具有很强的降解能力[16-17]。3种腐熟剂中真菌种类较为单一，以酿酒酵母为主，其常作为厨余垃圾堆肥初期的接种菌剂，有助于加速堆肥的进行[18]。

为了验证3种腐熟剂对玉米秸秆的腐熟效果进行 25 d 的腐熟试验，结果表明，3种腐熟剂均能促进玉米秸秆腐熟升温，延长高温阶段持续时间，降低挥发性固体物质和C/N，减少腐熟物的植物毒性，缩短腐熟时间，加快腐熟进程。大量的研究表明，在自然堆肥初期接种微生物菌剂能增加堆肥初期微生物数量，提高微生物代谢活性，加快有机物的降解，促进堆料的腐熟，例如在堆肥初期接种芽孢杆菌和链霉菌，可在堆肥过程中增加细菌数量，加速有机质分解[19]；接种EM菌剂有利于堆肥矿化作用，缩短堆肥腐熟时间5～8 d[20]。但也有学者认为，接种的外源微生物在与土著微生物竞争过程中处于劣势，难以形成优势菌，所以没有必要接种微生物菌剂[21]。

3种腐熟剂以南华腐熟剂对玉米秸秆的腐熟效果最好，接种南华腐熟剂处理组升温最快，高温维持时间最长，VS含量降低得最多，GI值最高，这可能与接种腐熟剂的有效活菌数量和种类有关。在同等接种量下，南华腐熟剂中有效活菌数量可达19.13×1010CFU/g，分别是康源和宜春腐熟剂细菌数量的5.74、4.00倍左右，可以增加腐熟初期微生物数量。南华腐熟剂中细菌主要是芽孢杆菌和魏斯式菌，真菌以酵母菌为主，这类微生物是常用的秸秆腐熟菌种，能产生纤维素酶、半纤维素酶类、葡聚糖酶等多种消化酶，对纤维素类的秸秆具有较强的降解能力，在有机肥制备、厨余垃圾处理以及环境净化方面有广泛的应用[22-23]。

4 结论

本研究表明，接种腐熟剂有助于促进玉米秸秆的腐熟，由于不同的腐熟剂中微生物种类不同，对堆肥腐熟程度的影响存在差异，为接种的微生物菌剂提供菌种资源，主要结论如下：(1)3种秸秆腐熟剂均为细菌、真菌、放线菌复合而成的微生物菌剂，有效活菌数由高到低依次为南华>宜春>康源，细菌是优势微生物；(2)3种腐熟剂真菌以酿酒酵母为主，细菌组成存在明显差异，康源腐熟剂中细菌主要是肠球菌，宜春腐熟剂中细菌以芽孢杆菌和侧孢芽孢杆菌为主，南华腐熟剂则以魏斯式菌和芽孢杆菌为主，康源腐熟剂存在潜在的环境风险；(3)3种腐熟剂均能促进玉米秸秆腐熟，缩短腐熟时间，达到无害化标准，其中南华腐熟剂更有利于玉米秸秆的分解，腐熟效果更好。

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