QuEChERS-高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱同时测定饲料中17种霉菌毒素

崔晓娜， 郭礼强， 葛爱民， 李 舫

(1.山东畜牧兽医职业学院，山东潍坊 261061； 2.潍坊出入境检验检疫局，山东潍坊 261041)

通信作者：李 舫，女，硕士，教授，主要从事家禽生产中生物安全控制技术研究。E-mail：sdmylifang@163.com。

霉菌毒素对人和动物是有害的，是霉菌在被污染的食品或饲料中产生的有毒代谢产物，其不仅会对粮食、饲料等产生严重的污染，引起人、畜中毒或死亡，而且有些霉菌毒素还具有“三致”作用，严重危害了人畜的健康。霉菌毒素的污染主要来自于农作物、饲料、食品的生产、加工及储存等各个环节[1-2]。已发现的霉菌毒素约有300种[3]，其中只有极少一部分被常规监管及残留监控。因此，评估和筛查常用霉菌毒素在饲料及农产品中的残留，对维护畜牧养殖业的健康发展及保护消费者的健康具有积极意义。

目前，在对多种霉菌毒素同时检测的方法中以液相色谱法[4-5]和液相色谱-质谱法[6-9]为常用的检测方法，但因其选择性差，很难对多种毒素同时检测，且灵敏度也达不到要求。液相色谱-质谱法方法的选择性好，操作简单省时，尤其是四极杆-飞行时间质谱属于高分辨质谱，具有质量范围广、高通量、高质量精度和分辨率、分析全面等优点，可根据毒素准分子离子的精确分子质量对其进行定性推导，显著提高了复杂基质下的抗干扰能力，而质谱获得的全扫描谱图可以用于建立化合物质谱数据库，因此，可以在不使用标准品的情况下通过已有数据库的信息对未知样品中的化合物进行定性判断[10-12]。目前，国内利用高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱筛查饲料中霉菌毒素的报道较少，但该方法的开发利用具有良好的应用前景。因此，本研究选择易污染粮谷饲料的常见产毒霉菌代谢物为研究对象，建立17种霉菌毒素的一级和二级谱库，并采用QuEChERS(quick、easy、cheap、effective、rugged、safe，简称QuEChERS)前处理提取方法，结合谱库检索建立饲料中17种霉菌毒素的快速高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱(high performance liquid chromatography-quadrupole-time of flight mass spectrometry，简称HPLC-Q-TOF/MS)测定方法，以期为企业及监管部门提供有效的技术支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料

Agilent 1290-6530高效液相色谱-飞行时间质谱仪，配电喷雾离子源(electrospray ionization，简称ESI)，购自美国Agilent公司；5810R离心机，购自德国Eppendorf公司；N-EVAP氮吹仪，购自美国Organomation Associates公司；Milli-Q超纯水机，购自美国Millipore公司；KQ-500超声波清洗器，购自江苏省昆山市超声仪器有限公司。

黄曲霉毒素(B1、B2、G1、G2)、赭曲霉毒素A、T-2毒素、HT-2毒素、橘青霉素、蛇形菌素、新茄镰孢菌醇、疣孢青霉原标准品，均购自BioPure公司；O-甲基杂色曲霉素、杂色曲霉素、环匹阿尼酸、青霉酸、伏马菌素(B1、B2)，购自Sigma公司。

中性氧化铝，购自杭州永星五交化有限公司；石墨炭黑粉、C18粉、N-丙基乙二胺(primary secondary amine，简称PSA)粉、氨丙基粉，均购自美国Agilent公司；甲醇、乙酸乙酯、乙腈、甲酸，均为色谱纯，均购自德国Merck公司；试验用水为超纯水。

将各标准品用乙腈溶解，配成质量浓度为100 mg/L的标准储备液，各50 mL，存储期6个月；再用乙腈配制浓度为 100 μg/L 的标准品中间液，再根据实际需要用饲料提取液稀释成合适浓度的混合标准工作液，于4 ℃保存，有效期3个月。

1.2 样品处理

准确称取5.0 g均质的试验样品置于50 mL离心管内，加入20 mL含1%甲酸的乙腈溶液(乙腈与水的体积比为 8 ∶2)，高速均质1 min，以10 000 r/min离心10 min，取8 mL上清液于15 mL干净的玻璃试管中，加入500 mg C18粉涡旋振荡，静置2 min后，取4 mL上层溶液于10 mL玻璃试管中，30 ℃水浴氮气吹干，用1 mL初始流动相溶液将其溶解，涡旋振荡1 min，经0.22 μm滤膜过滤后供HPLC-Q-TOF/MS分析测定。

1.3 色谱条件

色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)；流动相A为0.1%甲酸水溶液；流动相B为0.1%乙腈水溶液；梯度洗脱程序：0～2 min，5% B；2～12 min，5%～80% B；12～16 min，80%～95% B；16～17 min，95%～5% B；平衡3 min。进样体积为10 μL，流速为0.3 mL/min。参比质荷比范围为121.050 9～922.009 8。

1.4 质谱条件

气体温度为350 ℃，干燥气流量10 L/min，雾化气压力为310.26 kPa，电离方式为正离子模式，采用多反应监测模式采集，数据储存方式为柱状图，电压为4 000 V，碰撞能量为 20 V。17种霉菌毒素的部分质谱参数如表1所示。

表1 17种霉菌毒素的部分质谱参数

1.5 谱库建立

配制浓度为1 mg/L的霉菌毒素标准品，在不同碰撞能量(0、10、20、40 V)下分别对目标化合物进行测定，采集所需数据，建立目标化合物一级质谱全扫描筛查库和二级谱图库。通过谱库检索，以目标化合物的一级质谱精确分子量、保留时间、同位素丰度匹配、特征离子等信息进行定性分析，同时填写分子式和化学名称等。

2 结果与分析

2.1 提取条件的优化

饲料的基质成分较复杂，提取溶剂的选择对霉菌毒素回收率有重要影响。参考相关文献，排除毒性较大的四氯化碳、含苯环溶剂后，本试验先后采用甲醇、乙腈、异丙醇、甲醇水溶液[5]、乙腈水溶液[6-10，13]等5种溶液进行提取。结果表明，仅以甲醇、乙腈、异丙醇为提取溶剂时，17种霉菌毒素的回收率在15%～45%之间；使用甲醇-水作为提取溶剂时，回收率在44%～60%之间；使用乙腈-水作为提取溶剂时，回收率在50%～80%之间，比甲醇-水作为提取溶剂时的回收率最低提高了6%，且基质噪音更低，最终选用乙腈-水作为提取溶剂。同时考察了提取溶液的pH值对霉菌毒素回收率的影响，试验发现在提取溶液中加入1%甲酸后，回收率和稳定性进一步提高，推测一些霉菌毒素(伏马菌素B1、赭曲霉素A等)在中性或碱性环境下易分解，酸性环境更有利于提取。为提高净化效果，提高方法的灵敏度，本试验进一步考察了C18粉、石墨炭黑粉、中性氧化铝、PSA粉、氨丙基粉等5种QuEChERS净化粉[14-15]对17种霉菌毒素的吸附回收率，通过在霉菌毒素混合标准溶液(15.0 μg/kg)中添加5种净化粉，与混合标准溶液对比来计算吸附率。由表2可知，C18粉对17种霉菌毒素的吸附影响较低，目标分析物的回收率为96.2%～114.5%，其他4种净化粉对一些霉菌毒素的吸附较严重，达不到试验要求。

2.2 色谱条件的优化

对于飞行时间质谱，相似目标分析物基质或同分异构体对采集精确分子量数据影响较大，干扰谱库的检索，同时所测定的17种霉菌毒素母离子质荷比在169～723之间(表1)，化学性质相差很大，这些对色谱条件都提出了一定要求。试验考察了甲醇和乙腈2种有机流动相对目标分析物的影响，发现流动相为甲醇-水时，疣孢青霉原的峰形偏宽，灵敏度偏低；黄曲霉毒素B1与黄曲霉毒素B2的保留时间相差不大，干扰二级碎片离子分析。调整流动相为乙腈-水[6]，经多次试验最终确定了“1.2”节中所述流动相比例及梯度洗脱条件，应用该方法时基线平稳，各目标物能有效分离，目标分析物的一级、二级谱图响应值较好。

表2 经C18粉、石墨炭黑粉、中性氧化铝、PSA粉、氨丙基粉等5种净化粉吸附后17种霉菌毒素的回收率

2.3 质谱条件的优化

高分辨质谱筛查流程简单、通量高，非常适合做目标分析物和未知样品的筛查，对于已知化合物可以通过其标准品建立化合物的一级、二级谱图库，从而在未知样品质谱扫描后提取质谱信息，通过谱图库比对结果，直接对化合物进行定性、定量分析，从而提高检测者的工作效率。将目标化合物分别配制成质量浓度为10 mg/L的标准溶液。采用HPLC-Q-TOF/MS进行质谱数据的采集，以黄曲霉毒素B1(精确质荷比为329.065 7)为例，如图1所示，通过谱库检索，可以初步推断化合物的精确分子量、分子式、同位素峰等信息。统计17种霉菌毒素的保留时间和质谱信息(表1)，建成质谱库，包含保留时间、母离子、子离子、结构式等。

2.4 线性关系、检出限与定量下限

对17种霉菌毒素质量浓度在1.0～200.0 μg/L之间的系列混合标准溶液(用饲料基质提取液配制)进行测定，以各目标分析物峰面积的平均值(y)与其质量浓度(x)绘制标准曲线，其相关系数均大于0.990(表3)。在饲料基质中添加系列浓度的混合标准物质，以信噪比为3作为方法的检出限，以信噪比为10作为方法的定量下限。由表3可知，17种霉菌毒素的检出限为0.5～3.0 μg/kg，定量下限为1.0～10.0 μg/kg 。

2.5 实际样品的测定

对市场购买的20份饲料(全价饲料和玉米粉各10份)中的霉菌毒素含量进行测定，在1份玉米粉样品中检出黄曲霉毒素B2，含量为4.1 μg/kg。如图2所示，其中图2-a为疑似黄曲霉毒素B2提取离子流图，图2-b为通过谱库检索疑似样品和谱库匹配后提供的精确分子量信息，由此推断为黄曲霉毒素B2。为了检验结果的准确性，引用质检总局霉菌毒素行业标准[16]对阳性样品进行验证，检测结果为 4.3 μg/kg，小于国家标准(5.0 μg/kg)，与筛查检测结果比较吻合。

3 结论

本试验使用QuEChERS前处理技术结合液相色谱-飞行时间质谱快速筛查了饲料中17种常见霉菌毒素，在无需标准品的情况下，通过谱库检索，能够同时实现对饲料中17种霉菌毒素的定性、定量分析。通过对提取溶剂、QuEChERS净化粉、色谱质谱条件等进行优化研究，提高了该方法的灵敏度和通用性，可以满足饲料中常见霉菌毒素残留检测的需求。

表3 17种霉菌毒素的线性方程、相关系数、线性范围、检出限与定量下限

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