抗真菌活性化合物筛选及保鲜效果初步评价

林群英， 吴亮亮， 吴素玲， 石宝俊，2， 朱海亮， 张卫明

(1.中华全国供销总社南京野生植物综合利用研究院，江苏南京 210042； 2.亿利耐雀生物科技有限公司，江苏南京 210038； 3.南京大学生命科学学院，江苏南京 210093)

通信作者：石宝俊，博士，副研究员，主要从事植物化学成分研究。E-mail：jacksonshi@126.com。

食用菌营养价值高，富含蛋白和膳食纤维，且低脂肪，深受市场欢迎。随着食用菌产业的不断发展，其产量已经占全球80%以上。因食用菌大部分以鲜品形式进行流通，水分含量高，同时，工厂化生产具有强烈的地域性而农户生产则具有明显的季节性，造成的腐烂损耗量大。目前控制食用菌采后保鲜的最有效手段是冷藏处理[1-3]和气调措施[4]。由于冷藏保鲜需特定设备且成本高等因素，生产应用中受到限制。为满足食用菌保鲜的需求，开发合适的保鲜技术，是促进食用菌产业可持续发展的重要途径。保鲜剂是果蔬保鲜常用的保鲜技术，可有效抑制病原微生物，延长保鲜期[5-6]。目前食用菌保鲜剂多针对生理变化和细菌性病变进行研究，对抑制病原真菌的保鲜剂研究较少。亚硫酸钠、壳聚糖、L-半胱氨酸及CaCl2等已被用于银耳和金针菇保鲜研究，取得一定的效果[7-8]。本研究对60种化合物抗病原真菌活性进行测定，利用平板试验测定各化合物对产黑曲霉、黄青霉、杂色曲霉、绿色木霉和木霉等5种病原真菌的抑制率，根据初筛选结果，分析效果较好的化合物对病原真菌的量效关系，并以金针菇为材料初步验证其保鲜效果，为开发食用菌保鲜剂提供新材料。

1 材料与方法

1.1 材料

食用菌常见病原真菌：黑曲霉(Aspergillusniger)、产黄青霉(Penicilliumchrysogenum)、杂色曲霉(A.versicolor)、绿色木霉(Trichodermaviride)、木霉(Trichodermasp.)，由中华全国供销总社南京野生植物综合利用研究院提供。

PDA平板培养基：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂粉 20 g、KH2PO41 g、MgSO40.5 g，定容至1 L，121 ℃，灭菌 20 min，趁热制成平板培养基。

供筛选抑菌化合物：共60种，包括：含噻唑烷苯并二氢呋喃酮结构化合物(编号为ZTT，共5种)、含吲哚及吡唑酰胺结构化合物(编号为WZF，共13种)、含吲哚苯环酰胺结构化合物(编号为mrj，共18种)、含硝基咪唑及联苯吡唑类羧酸酯结构化合物(编号为CLW，共24种)，由南京大学生命科学学院提供。各化合物以无菌水配制成0.1 mg/mL浓度。

1.2 试验方法

1.2.1 病原真菌孢子混悬液制备 各病原真菌接种于PDA培养基内，28 ℃下培养7 d。用接种针刮取病原真菌孢子或菌丝，转至含1%吐温80水溶液中，充分混匀，利用血球计数板计算孢子浓度，将孢子浓度调整为2×106CFU/mL。

1.2.2 抗菌化合物对病原真菌的抑制率测定 将待测定的抑菌化合物剂溶液0.5 mL均匀涂布在PDA平板，以无菌水作为阴性对照组。经灭菌的直径为5 mm大小的滤纸片，加到含病原真菌孢子的混悬液内，使其充分沾上病原菌的孢子和菌丝，于平板中央接入将带孢子的滤纸片。20 ℃下培养 7 d，测定各菌落直径大小，计算抑制率。各试验设置3重复。以0.1%苯甲酸钠为阳性对照。

1.2.3 量效关系分析 选取平板试验中筛选所得的对病原菌抑制效果良好的化合物配制成梯度浓度(0.01 mg/mL、0.05 mg/mL、0.10 mg/mL)，采取无菌水作为阴性对照组。余下操作依“1.2.2”节进行。

1.2.4 化合物保鲜效果初步评价 选取金针菇新鲜子实体，各化合物浓度为10 mg/L，均匀喷洒至子实体表面，置于阴凉处晾干，用保鲜盒装好，20 ℃下放置4 d，进行水分、褐变度和可溶性还原糖测定[9]。所有试验于2017年1—7月在中华全国供销总社南京野生植物综合利用研究院进行。

2 结果与分析

2.1 抗真菌活性筛选

2.1.1 含噻唑烷苯并二氢呋喃酮结构化合物抗真菌活性 与阳性对照苯甲酸钠(图1)相比，含噻唑烷苯并二氢呋喃酮结构化合物(ZTT系列)中，除ZTT-2-32外，ZTT-2-31、ZTT-2-34、ZTT-2-41、ZTT-2-43均对黑曲霉有较好的抑制作用，其中ZTT-2-31和ZTT-2-43的抑制率均达19.23%(图2)。ZTT-2-41对杂色曲霉的抑制率为 16.88%。ZTT-2-32和ZTT-2-34对绿色木霉的抑制率分别为16.83%和15.58%。此系列化合物对产黄青霉的抑制率均低于10%。除ZTT-2-32外，其他化合物对木霉的抑制率亦低于10%，而阳性对照苯甲酸钠对木霉未显示出任何的抑制。由此可见，化合物ZTT-2-32和ZTT-2-43对5种病原真菌的抑制效果较好。

2.1.2 含吲哚及吡唑酰胺结构化合物抗真菌活性 含吲哚及吡唑酰胺结构化合物(WZF系列)中，WZF-39对黑曲霉的抑制率最高，达22.76%，其次是WZF-32，抑制率为19.51%，WZF-28、WZF-33、WZF-46和WZF-49对黑曲霉的抑制率均在10%以上(图3)。WZF-28、WZF-34和WZF-41对产黄青霉的抑制率均为16.48%。对杂色曲霉的抑制率在20%以上的化合物共有11个，其中以WZF-32最高，达32%。此系列的化合物对绿色木霉和木霉的抑制率偏低，大部分均低于10%。由此可见，WZF-39对5种病原真菌的抑制效果最好，其次是WZF-32。

2.1.3 含吲哚苯环酰胺结构化合物抗真菌活性 含吲哚苯环酰胺结构化合物(mrj系列)中仅mrj-87对黑曲霉的抑制率达10%以上，其余化合物均低于10%。mrj-87对产黄青霉的抑制率最高，为21.5%，其次是mrj-80和mrj-90。mrj-67 对杂色曲霉的抑制率最高，为21.89%，mrj-49和mrj-54对绿色木霉的抑制率均在20%以上，而mrj-70、mrj-86 和mrj-90对木霉的抑制率在20%以上，其中 mrj-90 的抑制率高达28.16%(图4)。结合对5种病原真菌的抑制率，mrj-70对单一病原真菌的抑制虽不突出，但其对5种病原真菌的抑制却最为全面。由此可推断，mrj-70和mrj-87是此系列抗真菌活性较好的化合物。

2.1.4 含硝基咪唑及联苯吡唑类羧酸酯化合物抗真菌活性 含硝基咪唑及联苯吡唑类羧酸酯化合物(CLW系列)对5种病原真菌的抑制效果较其他系列差，对黑曲霉的抑制率最高的是CLW-143，仅为11%(图5)。CLW-115对产黄青霉的抑制率最高，为16.24%，其次为CLW-120，抑制率为 14.79%，大部分化合物的抑制率在10%以下。CLW-140对杂色曲霉的抑制率为18.91%，大部分化合物的抑制率在10%以下。CLW-137对绿色木霉的抑制率最高，达24.4%，其次是CLW-115，为22.04%。另有12个化合物的抑制率在10%以上，其他的则低于10%。此系列化合物对木霉的抑制率不高，CLW-120为最高，抑制率为15.01%。

2.2 量效关系分析

化合物ZTT-2-32和ZTT-2-43对黑曲霉的抑制效果存在明显的量效关系，随着浓度的增大，抑菌率亦随之提高(图6)。化合物WZF-39和mrj87对产黄青霉抑制效果同样存在明显的量效关系(图7)。这4种化合物的结构式见图8。

2.3 化合物保鲜效果的初步评价

化合物WZF-39对金针菇的失质量率和褐变度有明显的抑制作用，失质量率和褐变率分别为4.73%和0.18(图9)。其次是ZTT-2-43和mrj-87，金针菇的失质量率和褐变度分别为5.07%、0.22和4.87%、0.25，明显低于空白对照组。这说明化合物对金针菇具有一定的保鲜效果。

3 讨论

通过对60种化合物对食用菌病原菌抑制率的测定、量效关系分析以及初步的保鲜效果评价，获得4种抗病原真菌效果较好的化合物，分别是含噻唑烷苯并二氢呋喃酮结构化合物2种(编号：ZTT-2-32和ZTT-2-43)、含吲哚及吡唑酰胺结构化合物(编号：WZF-39)、含吲哚苯环酰胺结构化合物(编号：mrj-87)。吡唑酰胺类化合物具有杀虫和抗菌等多种生物活性等方面有报道[10-11]，本研究筛选获得的 WZF-39 和mrj-87这2种化合物的抗真菌活性与前人报道相似。食用菌采后存贮和流通过程中，病原真菌是导致腐烂的重要生物因素，而这些病原真菌可能源于生产过程[12-13]，本研究针对病原真菌进行保鲜剂筛选开发，并获得4种抑制率较好的化合物，为开发食用菌专用型保鲜剂提供了良好的原料。这些化合物以天然化合物为基础，进行一定的结构修饰而成。这种方法解决了天然产物的提取工艺复杂，成本高，而且资源消耗非常大的问题[14]，为筛选出高效的绿色防腐保鲜剂提供了快捷有效的途径，为实现其工业化生产提供了重要的技术支撑。

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