基于AFLP的茶花种质资源遗传多样性研究

杨 旭， 吴德智， 袁 伟， 胡孝枝

(1.湖北生态工程职业技术学院，湖北武汉 430200； 2.湖北省麻城市国营五脑山林场，湖北麻城 435000)

通信作者：胡孝枝，高级工程师，主要从事花卉资源培育方面的研究。E-mail：964216884@qq.com。

茶花是山茶科山茶属中具有观赏价值的常绿灌木或小乔木的统称，其形姿优美、叶片浓绿有光泽、花色各异、花型繁多，是世界名贵花卉之一。目前全世界的茶花品种已达3万余种[1]，中、日、英、美、意、法、德、澳大利亚、新西兰等国都有栽培和繁育。我国是茶花的起源中心，资源极其丰富，已培育出的近千个茶花品种在园林工程和园艺盆景上应用广泛，因此茶花也被称为“中国十大名花”之一[2]。

茶花经过长期的异花授粉和自然选择，产生了许多新品种，种质交流频繁，但由于我国茶花品种分类缺乏系统性研究，同名异物和同物异名现象严重，导致出现品种间遗传差异小、品种创新不足等问题[3-4]。而以往对茶花品种的研究多以形态观察、细胞学等为主，这种方法无法摆脱环境饰变的影响，存在很大的局限性和不确定性，对性状相似的品种很难鉴别。在此背景下，新的遗传多态性检测手段——DNA分子标记技术应运而生，目前已有许多学者利用随机扩增多态性DNA(random amplification polymorphic DNA，RAPD)、简单序列重复(simple sequence repeat，SSR)、简单序列重复间(inter-simple sequence repeat，ISSR)、限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)等对茶花开展了相关研究，而利用限制性扩增片段长度多态性(amplified fragment length polymorphism，AFLP)分子标记技术对茶花种质资源遗传多样性进行研究的报道甚少。与其他分子标记方法相比，AFLP具有用量少、可重复性好、多态性强、分辨率高、试验结果稳定可靠等特点[5-8]。本研究应用此方法分析了35份茶花种质资源的遗传多态性和亲缘关系，以期为茶花鉴别、杂交育种及其起源演化提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

供试茶花品种共35份(表1)，均采自湖北省麻城市国营五脑山林场内的茶花种质资源圃。

表1 供试的茶花品种

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 采集茶花新梢叶片，装入含有硅胶的自封袋中，干燥后放入-20 ℃冰箱中，采用CTAB法[9]提取样品基因组DNA。

1.2.2 AFLP分析 酶切体系(20 μL)：4 μL 10×Buffer tango，0.4 μLEcoRⅠ(10 U/μL)，0.4 μLMseⅠ(10 U/μL)，37 ℃ 3 h接着65 ℃ 3 h条件下完成。加入2 μL 10×T4Buffer，1 μLEcoRⅠ酶切头(adaptor)(50 μmol/L)，1 μLMseⅠ adaptor(50 μmol/L )，10 μL T4DNA连接酶，0.4 μL(5 U/μL)酶切产物，16 ℃连接，过夜。利用Primer-EcoRⅠ-A和Primer-MseI-C进行预扩增。选择性扩增反应体系(20 μL)为2 μL 10×Buffer，0.4 μL 10 mmol/L脱氧核糖核苷三磷酸(deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTPs)，0.2 μL 5 U/μLTaq酶，5 μL预扩稀释液。PCR扩增程序为95 ℃预变性5 min；95 ℃变性35 s，65 ℃复性35 s，72 ℃延伸1 min，12个循环；94 ℃变性30 s，56 ℃复性30 s，72 ℃延伸1 min，23个循环。6%变性聚丙烯酰胺胶电泳分离，银染显色。试验所用AFLP接头及选择性扩增引物序列见表2。

1.2.3 数据分析 利用GeneMarker 2.2软件将35份样品、7对引物组合扩增得到的原始数据进行分析，将各泳道内分子量内标的位置与各样品峰值的位置作比较分析，得到片段的大小，再根据无带和有带情况转化为0，1数据矩阵。依据Nei等的方法[10-11]，利用POPGENE和NTsys-pc 2.1软件[12-13]对样品进行遗传多样性分析。

2 结果与分析

2.1 7对引物组合的扩增效率

选用7对引物组合对35份茶花品种进行扩增，结果(表3)显示，共分离出508条清晰有效的条带，其中456条具有多态性，占89.76%；平均每对引物组合扩增出72.6条，其中65.1条具有多态性。可以看出，利用AFLP进行基因多态性检测，效率高且扩增片段多、多态性高，有利于品种间遗传差异的分析。7对引物扩增出的观察等位基因数范围为1.878 8～1.915 9个，有效等位基因数范围为1.419 7～1.548 1 个，Nei’s基因多样性指数(H)范围为0.255 9～0.320 3，香农指数(I)范围为0.396 5～0.476 7，具有较丰富的遗传多样性。

表2 引物和接头序列

表3 7对扩增引物产生的条带多态性及遗传多样性水平

2.2 茶花品种的分子系统树

利用非加权组平均(unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA)聚类法对35份供试茶花品种进行遗传距离矩阵分析，形成分子系统树(图1)。当以平均遗传距离(0.69)来划分时，可分成三大类群：大类群Ⅰ为皮斯先生、难忘、毛缘黑玛瑙、白宝塔、皇家天鹅绒、依莎安妮、黄达、抓破脸、牛西奥转马、撒威达的梦、道温的曙光、狄斯、哈氏微笑、红十八学士、女皇二号、大和锦、花芙蓉、可娜、琳布蕾、麻姑仙子、花鹤翎、乱世佳人、爱丽牡丹王和黛安娜皇后等24个品种，其又可分为2个亚类群，亚类群Ⅰ包括17个品种，亚类群Ⅱ包括7个品种；大类群Ⅱ为狮子笑、六角大红、金盘荔枝、闪烁、牛西奥美玉、丝纱罗、大卡特等7个品种；大类群Ⅲ包括娃丽娜深、帕克斯先生和情人节等3个品种；而黑魔法则未被划入三大类群之中。

2.3 品种间的亲缘关系

从表4可知，品种间的遗传相似系数范围为0.17～0.52，平均系数为0.37；遗传距离范围为0.50～0.84，平均距离为0.69。娃丽娜深和女皇二号之间的相似性系数最大(0.52)，说明它们亲缘关系较近，且具有较小的遗传距离(0.66)；花鹤翎和乱世佳人的相似性系数最小(0.17)，说明它们的亲缘关系最远，遗传距离也最大(0.84)。

3 结论与讨论

据报道，倪穗等利用ISSR技术对国内外20个茶花品种进行了遗传多样性分析，21对引物扩增出153条条带，多态性为95.4%[14]；张景荣等利用RAPD技术对国内外23个茶花品种进行种质资源遗传多态性的研究，10对引物扩增出126条条带，多态性为88.2%[15]；申屠文月等结合RAPD分子标记技术对山茶花3个栽培变异新品种的遗传差异进行分析，多态性为51.7%[16]。而本试验利用AFLP技术对35个茶花品种的遗传多样性进行研究，7对引物扩增出508条条带，多态性为89.76%，平均遗传距离为0.69，可见茶花品种间遗传多样性高，能准确且高效地反映基因组组成上的差异，可以较好地区分表型特征非常相似的基因型，如花鹤翎和乱世佳人、牛西奥美玉和抓破脸等，这说明AFLP适用于茶花品种间的遗传多样性分析和种质资源鉴别，是研究茶花种质的有效方法之一。此外，研究结果还显示，随着资源和引物数量的增加，多态性程度也会提高[17]。

表4 样品间的Nei和Li相似系数(对角线下方)和遗传距离矩阵(对角线上方)

编号123456789101112131415161718290．400．310．350．360．310．350．430．380．400．390．360．340．380．340．420．360．360．37300．450．410．410．400．350．350．440．370．400．400．400．360．330．320．430．330．400．35310．380．310．360．390．370．390．460．390．380．410．440．370．340．330．390．300．390．32320．470．430．440．380．390．400．470．370．390．410．380．380．380．350．400．310．400．31330．360．330．330．360．310．350．380．330．340．360．410．300．360．300．520．360．340．31340．490．430．440．460．440．430．500．390．430．450．450．420．440．440．280．410．340．35350．380．330．340．380．360．360．350．380．370．350．410．320．380．390．470．320．330．33编号192021222324252627282930313233343510．690．660．700．690．660．630．700．690．680．710．670．640．690．620．700．610．6920．710．670．720．710．730．610．680．710．690．710．730．660．730．650．720．650．7230．700．690．740．690．720．690．730．740．690．710．710．660．690．650．720．650．7140．720．690．690．700．660．680．710．670．660．690．690．670．680．680．700．630．6850．710．680．720．710．690．650．710．730．710．690．730．700．690．680．740．640．7060．690．670．730．670．650．660．710．710．690．700．710．700．680．670．710．650．7070．650．640．680．670．680．620．680．680．640．660．650．650．630．630．690．610．7080．700．710．730．740．680．690．670．700．700．710．680．690．680．690．720．680．6990．700．670．740．680．700．660．720．720．700．710．670．670．680．680．710．650．69100．720．670．700．700．660．650．680．680．670．720．680．670．660．660．700．640．70110．720．700．660．720．690．650．670．690．660．680．700．670．650．680．670．640．66120．700．700．700．690．720．670．680．720．690．740．710．690．690．690．740．660．73130．740．720．720．710．690．690．720．710．670．710．690．720．710．680．690．640．68140．760．740．720．840．680．690．710．730．730．690．710．720．720．700．740．640．68150．640．630．650．650．650．740．650．660．640．650．660．650．680．670．600．760．62160．700．690．780．710．710．680．680．740．690．720．700．720．740．740．700．670．73170．690．690．730．700．690．680．700．730．740．700．690．670．680．670．710．710．72180．690．680．720．690．700．660．680．740．720．680．690．710．730．740．730．700．7219—0．730．690．760．690．680．740．710．690．730．720．710．710．680．700．660．70200．32—0．690．700．690．670．670．680．700．710．710．730．680．700．720．660．68210．370．37—0．700．710．690．710．750．700．700．700．690．730．700．720．670．72220．280．360．35—0．680．680．670．700．700．720．710．700．750．680．730．650．68230．370．370．340．38—0．620．670．720．680．700．700．680．700．690．700．650．69240．390．400．370．390．47—0．690．650．660．700．640．680．660．690．650．770．63250．300．400．340．400．400．37—0．720．710．690．690．670．690．680．700．680．69260．340．390．290．350．330．430．33—0．770．690．740．710．770．710．730．690．71270．370．360．350．360．390．420．350．26—0．690．720．710．760．710．710．720．67280．310．340．350．330．360．360．370．360．37—0．720．700．700．690．700．660．71290．330．340．350．340．350．450．380．300．330．33—0．730．730．700．700．660．69300．350．310．370．360．380．390．400．340．340．350．31—0．740．770．700．640．68310．340．390．310．280．350．410．380．270．270．350．310．30—0．740．750．670．71320．380．350．360．390．370．370．390．340．340．380．350．260．30—0．690．680．66330．350．330．330．320．360．440．350．310．340．350．360．360．290．37—0．650．74340．410．410．400．430．440．270．390．370．320．420．420．450．400．380．43—0．67350．350．390．330．390．370．470．380．350．400．340．380．390．340．410．310．40—

注：编号同表1。

通过UPGMA聚类分析可以发现，供试的35份材料被分成3个大类群，结果与理论上期望的有所偏差：一是来自同一种群的品种聚类情况存在差异。帕克斯先生、情人节、娃丽娜深和大卡特都是云南山茶与红山茶杂交选育出来的品种，前三者同聚于大类群Ⅲ，而大卡特却与闪烁、牛西奥美玉、丝纱罗等红山茶同聚于大类群Ⅱ，这可能是由于茶花在长期的引种培育与传播过程中交换了遗传物质[18]，也有可能是在流通过程中混淆了表型相似的品种，导致供试材料的真实性有误。二是相同地理起源的品种聚类情况存在差异，如皇家天鹅绒、黄达、道温的曙光、闪烁、牛西奥美玉等都是美国加州牛西奥苗圃选育出来的红山茶，前三者在大类群Ⅰ，后两者在大类群Ⅱ，这可能与引物偏少而使分子标记的数量受限有关[19]，也可能是不同品种为了适应新的环境发生了相似性的变异。

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