茶树叶片扫描电镜样品制备方法的比较研究

杨国一， 于文涛， 蔡春平， 陈 笛， 谢微微， 王鹏杰， 叶乃兴

(1.福建农林大学园艺学院/茶学福建省高等学校重点实验室，福建福州 350002； 2.福建出入境检验检疫局，福建福州 350001)

通信作者：叶乃兴，教授，主要从事茶树栽培育种与资源利用研究，E-mail：ynxtea@126.com；于文涛，博士，农艺师，主要从事植物系统学研究，E-mail：wtyu@foxmail.com。

应用扫描电镜观察生物样品表面的微形态特征，以获得较光学显微镜观察结果更为细微的结构特征，得到具有特异性功能的微观结构和具有分类学意义的微形态性状[1-4]，是生物学研究的重要手段之一。在利用扫描电镜对生物样品的微形态进行观察分析研究中，能否获得真实、清晰、理想的扫描电镜观察结果，样品的制备过程是关键，绝大多数情况需要对生物样品进行干燥处理后才能镀金和进行扫描电镜观察[5]。样品的前期干燥处理直接影响后期观察效果，如果处理不好，会直接影响到观察的清晰度与准确度，甚至直接导致试验失败[6]。含水量较多的生物样品不仅对扫描电镜成像造成很大的影响，同时对扫描电镜仪器设备也会造成诸多不良后果[7]：样品含水量多容易造成样品仓内真空度下降，造成电子束偏移，使图像模糊不清；造成物镜、镜头、光阑等部件的污染；灯丝碰到水蒸气而氧化变质乃至熔断。目前，植物叶片电镜扫描研究中的干燥方法主要有烘箱干燥法[8-9]、自然干燥法[10-12]、真空冷冻干燥法[13-16]等方法。

对于茶树叶片来说，茶树老叶和嫩叶含水量、角质层和上下表皮厚度都有所差异[17]，不同的叶片适合哪种干燥方式，还没有确切的数据支持。为了探讨茶树老、嫩叶片对应的最优干燥方法，本研究选取3个品种的茶树叶片为研究对象，每个茶树品种取老叶以及嫩叶作为试验材料，用场发射扫描电镜观察，然后对3种不同的茶树叶片扫描电镜样品制备方法进行比较，旨在寻找一种理想的茶树叶片扫描电镜样品制备方法，为茶树品种叶片微形态比较研究、茶树叶片发育过程的微形态研究等提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

试验材料采自福建农林大学教学茶园的3个品种(表1)的茶树叶片，分别为春梢叶(老叶)和秋梢第3叶(嫩叶)，采样时间为2016年10月下旬。

表1 3种茶树品种的性状描述

1.2 仪器设备

SU-8010型冷场发射扫描电镜(日立公司，日本)；E-1010 型离子溅射镀膜仪(日立公司，日本)；DHG-9240A型可编程电热烘箱(上海一恒科学仪器有限公司，中国)；FD-1-50型真空冷冻干燥机(北京博医康实验仪器有限公司，中国)；KQ-300VDE型超声波清洗仪(江苏昆山舒美超声仪器有限公司，中国)。

1.3 试验方法

每个茶树品种选取老叶及嫩叶，用超声波清洗仪去除茶树叶片表面的杂质，于同一叶片中部选取3个2 mm×2 mm大小的部分叶片作为试验材料，分别进行烘箱干燥法、硅胶干燥法和真空冷冻干燥法处理。

烘箱干燥法：将清洗过的茶树叶片样品放入60 ℃烘箱中干燥4 h。

硅胶干燥法：将清洗过的茶树叶片样品直接放入硅胶中进行干燥处理12 h。

真空冷冻干燥法：用2.5%的戊二醛于4 ℃ 冰箱中固定3 h；用0.1 mol/L、pH值6.8的磷酸缓冲液冲洗3次，每次 10 min；分别用50%、70%、80%、90%乙醇进行脱水，每次 15 min；用无水乙醇脱水3次，每次15 min；最后将材料置于100%纯叔丁醇中浸泡15 min后放入真空冷冻干燥机进行干燥处理。

将3组样品观察面向上，用导电胶带固定于扫描电镜样品台上，用离子溅射镀膜仪在样品表面镀膜80 s。冷场发射扫描电镜取8.0 mm工作距离、20 μA灯丝电流、6 kV加速电压，在200倍和500倍放大倍数下对茶树叶片进行观察并拍照。每个处理在200倍放大倍数下取10个视野，对视野中的叶片气孔数量进行统计，用SPSS 20.0软件进行单因素方差分析。

2 结果与分析

由显微图像(图1、图2、图3、图4)可以看出，3个品种的茶树叶片背面均有毛被，为单毛；气孔均为复唇型气孔，长卵形且具有腺鳞组织，气孔器保卫细胞蜡质纹饰平滑。茶树老叶气孔器保卫细胞均凸出于普通表皮细胞，气孔器外围覆有2层皱脊，内层呈平滑、环状闭合，外层褶皱、环状不闭合，副卫细胞与普通表皮细胞在同一平面；茶树嫩叶气孔器保卫细胞略突出于普通表皮细胞，气孔器外围覆有1层皱脊，呈平滑、环状闭合，副卫细胞略低于普通的表皮细胞。

2.1 茶树叶表面纹饰与变化

由表2可知，不同茶树品种叶片腹面均有独特的纹饰特征，而相同的茶树品种经不同干燥方法处理后，微形态特征存在差异。

烘箱干燥法：3个品种的茶树叶片经过烘箱干燥处理后，在扫描电镜观察下，茶树老叶原始形态保存良好，可以反映真实的微形态特征。而茶树嫩叶表面发生较为严重的收缩，叶片腹面褶皱较为严重， 其表面纹饰均不能反映其真实的微形态特征。

硅胶干燥法：经过硅胶干燥处理后的茶树老叶，在扫描电镜观察下，3个品种的茶树叶片并没有发生严重的皱缩现象。茶树嫩叶经硅胶干燥处理后，在扫描电镜观察下，其叶表面发生严重的收缩，叶片腹面褶皱严重，其表面纹饰不能反映真实的微形态特征。

真空冷冻干燥法：3个品种的茶树叶片经过真空冷冻干燥处理后，在扫描电镜观察下，茶树老叶和嫩叶的原始形态均保存良好，均可以反映真实的微形态特征。

表2 3种干燥方法对茶树叶片微形态的影响

2.2 茶树叶表面气孔密度与变化

对3个品种的茶树老叶和嫩叶进行气孔密度统计及方差分析(表3)，在茶树老叶结果方面，本山和铁观音2个品种的老叶经3种方法处理后，其气孔密度差异不显著，而黄旦经硅胶干燥法处理后气孔密度与烘箱干燥法和真空冷冻干燥法均差异显著；在茶树嫩叶结果方面，3个茶树品种经烘箱干燥法和硅胶干燥法处理后气孔密度均与真空冷冻干燥法差异显著，其气孔密度较真空冷冻干燥法均产生了较大的增加，其中本山嫩叶经烘箱干燥法处理后，气孔密度达到了 437.67 个/mm2，较真空冷冻干燥法增加了53.75%。

2.3 综合分析

茶树叶片经3种不同干燥方法处理后，茶树老叶和嫩叶呈现出不同变化：茶树老叶经烘箱干燥法或真空冷冻法处理后，其叶片未发生收缩现象，表面纹饰和气孔密度均未受到影响，能反映真实的微形态特征，而经硅胶干燥法处理后，虽然3个茶树品种的叶片微形态特征均在视野中保存较好，但黄旦品种气孔密度异常，因此硅胶干燥法并不适用于所有茶树品种老叶干燥处理；茶树嫩叶经真空冷冻干燥法处理后，叶表面未产生收缩现象，其表面纹饰和气孔密度均未受到影响，能反映真实的微形态特征， 而经烘箱干燥法或硅胶干燥法处理后，均发生严重的收缩现象，叶片表面纹饰和气孔密度均受到了不同程度的影响，不能反映真实的茶树叶片微形态特征，因此烘箱干燥法和硅胶干燥法并不适用于茶树嫩叶的干燥处理。

表3 经3种干燥方法处理后的茶树叶片平均气孔密度及方差分析结果

注：同列数据后的不同小写字母表示不同处理方法差异显著(P<0.05)。

3 讨论与结论

本研究中3种茶树叶片扫描电镜样品制备干燥方法的原理各不相同：烘箱干燥法是利用热空气将热量传递给叶片，气化叶片中的水分，形成水蒸气，从而达到快速干燥的效果；硅胶干燥法是通过硅胶干燥剂内部的毛细孔网状结构吸收水分，并通过其物理吸引力将水分保留，从而使样品脱水干燥；真空冷冻干燥法是将叶片在较低的温度下冻结成固态，然后在真空条件下使其中的水分不经液态直接升华为气态，最终使叶片脱水。对茶树叶片进行干燥处理时，由于水具有较大的内聚力和电极性，可与样品中的极性成分瞬间结合，在挥发干燥时会牵动样品组分，如果叶片较嫩，含水量较高，有可能造成样品收缩变形或微小断裂。在茶树老叶扫描电镜制样过程中，由于其含水量少，角质层和上下表皮厚度较厚等特点，烘箱干燥法和真空冷冻干燥法均适合， 但考虑到真空冷冻干

燥法的操作复杂性及成本相对较高，在进行茶树老叶片的扫描电镜研究中，采用烘箱干燥法是简便、经济、快速的制样方法。在茶树嫩叶扫描电镜制样过程中，茶树嫩叶含水较多，角质层和上下表皮厚度较薄，采用烘箱干燥法或硅胶干燥法处理时容易发生变形收缩现象，影响观察结果，而真空冷冻干燥法是选用高熔点的有机溶剂——叔丁醇作升华介质，使水分从固态直接转化为气态，不经过液态阶段，因而避免了气相和液相之间表面张力对样品的损伤[18]。

综上，在茶树品种叶片微形态学比较研究、茶树叶片发育过程研究等茶树叶片微形态学相关研究中，如果选用茶树老叶作为研究材料，建议采用更简便、经济、快速的烘箱干燥法进行样品制备；如果需要对嫩叶的微形态特征进行观察，建议采用保留真实形态更佳的真空冷冻干燥法作为扫描电镜样品制备的优选方法。

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