与番茄果实颜色连锁的InDel标记及其应用

王仁汉， 李文丽， 王 富， 王 辉

(青岛农业大学园艺学院，山东青岛 266109)

番茄(Solanumlycopersicon)属于茄科番茄属，是世界范围内广泛种植的蔬菜作物之一。番茄果实色泽是叶绿素、类胡萝卜素、类黄酮和花青苷等多种色素的综合表现[1]，随着果实发育代谢过程中相关色素含量及组分的变化，果实颜色表现出差异性，类胡萝卜素中的番茄红素在果实颜色形成中具有决定性作用[2-4]。番茄果实颜色受到很多基因控制，现已研究发现至少有9个基因位点(r、t、B、Del、dg、hp、ogc、MOB等)对番茄的果实颜色有很大的影响[5-8]。近年来，有研究证实MYB转录因子在番茄果实颜色形成中发挥决定性作用[9]。黄三文等研究发现，在粉果番茄SIMYB12基因起始密码子上游4 kb处存在大小为603 bp的DNA序列缺失，并开发为InDel标记InDel-P[10]。本研究利用与番茄果实颜色相关的InDel-P分子标记对4份红果番茄高代自交系和4份粉红果番茄高代自交系进行PCR检测，随后对48份后代材料进行PCR检测，试图验证InDel-P标记是否可用于番茄果实颜色分子标记辅助筛选，进而加快番茄果实色泽选育进程。

1 材料与方法

1.1 材料

试验材料取自青岛农业大学园艺学院番茄育种田，共计56份。红果番茄高代自交系4份，编号P1～P4，粉红果番茄高代自交系4份，编号P5～P8。待检测分离后代番茄材料计48份，其中编号1～24为粉红果普通番茄，编号25～28、45～48为红果普通番茄，编号33～38为黄果樱桃番茄，编号39～44为粉红果樱桃番茄。

1.2 方法

1.2.1 引物设计 鉴定番茄果实颜色相关的InDel分子标记的引物参照黄三文等提供的序列[10]合成；引物序列见表2，所用引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表2 鉴定所用的特异性引物信息

1.2.2 番茄样品DNA的提取纯化及检测 使用北京天根生物科技有限公司植物DNA提取试剂盒提取样品DNA，提取方法参照试剂盒说明书。1.0%琼脂糖凝胶电泳检测DNA。

1.2.3 PCR扩增反应 PCR反应体系：模板DNA(20～80 ng/μL)5.0 μL，10×PCR Buffer(含Mg2+)2.5 μL，高纯dNTPs(2.5mmol/L)2.0μL，引物F/R(10μmol/L)各1.0 μL，easyTaqDNA polymerase(5 U/μL)0.3 μL，ddH2O补足 20 μL。PCR反应程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性 30 s，58 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸30 s，35个循环；72 ℃延伸 10 min；4 ℃保存。取PCR扩增产物约10 μL，在1%琼脂糖凝胶电泳上检查PCR扩增结果，自动凝胶成像系统观察照相，记录电泳结果。

2 结果与分析

2.1 试验样品DNA质量检测

提取的DNA电泳条带明亮整齐(图1)，符合PCR分析要求。紫外分光光度计检测样品浓度D260 nm/D280 nm<2.0，取5.0 μL DNA母液稀释至约40 ng/μL用于PCR扩增。

2.2 与番茄果色性状相关的标记在8份已知果色的高代自交系中的验证

利用与番茄果实颜色相关的标记InDel-P对8份已知果色的番茄高代自交系中的PCR扩增结果显示(图2)，在4份不同来源的红果番茄高代自交系中均可扩增出960 bp的特异DNA片段，另外在750、500 bp左右还有2条较弱的非特异性扩增条带，而在4份不同来源的粉红果番茄高代自交系中均可扩增出360 bp的特征谱带， 可见该标记能很好地用于区分红果番茄和粉红果番茄材料。

2.3 与番茄果色性状相关的标记在48份番茄分离后代中的应用

为了验证InDel-P分子标记与番茄果色基因间的连锁关系，对48份番茄分离后代进行PCR验证试验，结果显示，(图3)在32份普通番茄中有2份未扩增出条带，有17份扩增出360 bp的DNA特异性条带，有9份扩增出960 bp条带，此外，有4份同时扩增出2条条带，说明控制果色的基因位点处于杂合的状态；16份樱桃番茄中有11份后代材料扩增出360 bp的特征条带，分子鉴定结果为粉红色；另外5份材料仅扩增出960 bp的特征谱带，分子鉴定结果为红色。针对这48份材料的果实颜色进行严格的田间调查统计，田间调查结果(表3)显示，30份普通番茄中有4份材料(编号为5、6、9、14)的果实颜色与分子鉴定结果存在出入，16份樱桃番茄中有6份材料(编号为33、34、35、36、37、38)的果实颜色与分子鉴定结果存在出入。所涉及的普通番茄材料中分子检测的准确率为86.7%，樱桃番茄材料中的准确率为62.5%，可见该标记可有效地用于普通番茄分子标记辅助选择，而樱桃番茄的准确率较低。

表3 供试番茄材料PCR检测情况

3 小结

番茄的颜色取决于果肉与果皮的颜色，受很多基因控制，番茄果皮受Y-y等位基因控制，果肉红、黄和橙等常见的3种颜色由R-r与T-t这2对等位基因控制，T-t基因对于R基因起隐性上位作用[11-12]。尽管番茄果实颜色受多个遗传位点控制，但是控制番茄果皮颜色的Y基因是一个转录因子SIMYB12在调控果实颜色方面具有重要作用[9]。黄三文等基于转录因子基因SIMYB12开发了与番茄果实颜色密切相关的InDel标记InDel-P[10]，理论上该标记可以实现番茄果色的分子标记辅助选择。

本研究对番茄果色性状相关的标记InDel-P在育种中的应用价值进行了考察，该标记可在普通红果番茄中同时扩增出960 bp的DNA特异片段，而在普通粉果番茄中仅扩增出360 bp的特异片段。对48份番茄分离后代进行PCR检测和田间鉴定，结果显示，普通番茄分子鉴定与田间鉴定的吻合度为86.7%，樱桃番茄材料中的准确率为62.5%，可见该标记可有效地用于普通番茄分子标记辅助筛选，而在樱桃番茄中的利用效率较低。

转录因子SIMYB12为控制番茄果皮颜色的Y基因，该基因的表达导致番茄果皮中积累大量类黄酮而成为黄色，最终使得果肉颜色为红色的番茄最终呈现红色，而粉果果皮中该基因不表达，所以果皮中没有类黄酮的积累，从而使红肉果实最终呈现粉色[9-10]。由此可以推断，黄果番茄果皮中SIMYB12应该是表达的，从而PCR可扩增出960 bp的DNA特异片段，这也基本解释了5份黄果樱桃番茄(编号为34～38)分子鉴定表现为红色的结论。

本研究中有4份材料分子鉴定结果显示SIMYB12基因在这4份材料中处于杂合状态，而田间鉴定颜色表现为粉红色，这不能用红色对于粉红为显性的遗传规律进行解释；另外，编号为33的黄果樱桃番茄果色颜色与分子鉴定颜色之间也无法合理解释，这些同样反映了番茄果实颜色遗传的复杂性。

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