新现猪圆环病毒3型及圆环病毒2型双重PCR检测方法的建立与应用

张帆帆，李龙显＊，叶 昱，李 凯，郭楠楠，张 敏，黄冬艳，吴 琼，何后军，宋德平*，唐玉新*

(1.江西农业大学 动物科学技术学院，江西 南昌 330045;2.江西农业大学 畜禽防治研究所，江西 南昌 330045)

猪圆环病毒(porcine circovirus,PCV)最早由德国学者从传代的PK15细胞中发现并分离，当时发现的是不致病的猪圆环病毒1型(porcine circovirus type 1,PCV-1)[1]。后来加拿大学者报道了仔猪断奶后多系统衰竭综合征(PMWS)的出现，并证实PCV-2为主要病原；此后，PCV-2在全世界分布广泛，引起PMWS、皮炎肾病综合征(PDNS)、猪呼吸道疾病综合征、繁殖障碍、增生性坏死性肺炎(PNP)等猪圆环病毒相关疾病(PCVAD)，是威胁世界养猪业的重要病原之一[2]。随着我国养殖业不断走向现代化、超大规模化，新型病毒的发现及混合感染，给养猪业造成巨大经济损失[3-6]。2016年，美国学者Palinski和Phan在利用高通量测序方法从暴发皮炎肾病综合征和繁殖障碍的母猪及其流产胎儿样品中发现了一种新的圆环病毒亚型——猪圆环病毒3型(porcine circovirus type 3,PCV-3)[7-8]。

据报道，PCV-3可导致母猪厌食、皮炎肾病综合征、繁殖障碍，如流产、产木乃伊胎、死胎、弱仔等症状，其症状与PCV-2相似；由于PCV-3可从患有PDNS症状母猪及其流产胎儿体内检出，间接证明PCV-3具有垂直传播的特性；同时有研究表明该病毒可通过公猪精液传播[7-9]。在我国，新现的PCV-3也被检出和报道。Fan等[10]报道从湖北和广东发生繁殖障碍的母猪和急性死亡仔猪体内发现了该病毒。Shen等[11]和Ku等[12]报道表明我国已有13个省的猪群中都感染了PCV-3，主要分布在中东部地区。Ku等[12]报道的通过普通PCR从辽宁、重庆3个猪场中的222份样品中发现，PCV-3和PCV-2单独感染率各为62.2%和34.7%，混合感染率为15.8%。

鉴于PCV-3和PCV-2所引起的疾病症状非常相似，在临床上很难区分，且PCV-3呈现多地域感染的现状，建立快速、准确的鉴别PCV-3和PCV-2的方法是有效诊断和防控我省猪群感染PCV-3和PCV-2的基础。本研究拟建立检测PCV-3和PCV-2的双重PCR，并对疑似圆环病毒感染的猪只样品进行检测，以了解江西地区PCV-3及其与PCV-2混合感染情况，为新现PCV-3感染的流行病学调查及临床诊断提供切实可行的方法。

1 材料与方法

1.1 病料及主要试剂

1.1.1 样品与病毒 2016—2017年采自江西省南昌、九江、宜春、抚州、新余、赣州、吉安7个地区有繁殖障碍猪呼吸道疾病综合征、体质量下降的猪群的组织器官；PCV-1、PCV-2、PRV、CSFV、PRRSV、PEDV、PDCoV、TGEV、PAstV等病毒阳性样品于本实验室鉴定和保存，PCV-3阳性样品来源于检测测序鉴定为阳性的样品。

1.1.2 主要试剂 平衡酚、Ex Taq DNA聚合酶、DL2000 DNA marker、dNTP Mixture、胶回收试剂盒及pMD-18T载体等均购置Takara(大连)公司，TOP10感受态细胞购自北京天根生化有限公司。

1.2 引物设计

用 MEGA 6.0比对GenBank数据库目前所有的PCV-2、PCV-3的ORF2基因序列，根据其保守序列用Primer 3.0在线软件分别设计了1对扩增PCV-2、PCV-3 ORF2基因片段的特异性引物(表1)，引物由上海生工生物工程有限公司合成。

表1 引物序列

1.3 病毒核酸的提取

病料按1∶2体积用0.01 mol/L pH 7.0 PBS稀释后匀浆，反复冻融3次；冻融好的样品涡旋3～5 min，8 000×g离心10 min；取400 μL上清液加500 μL细胞裂解液，37 ℃孵育30 min后加入500 μL平衡酚，连续剧烈震荡15 s后静置2 min；10 000×g离心5 min；吸取400 μL上清液至新的无菌EP管中，加入500 μL氯仿/异戊醇(24∶1)，漩涡振荡混匀，常温静置5 min；10 000×g离心5 min；吸取上清200 μL加入500 μL无水乙醇、10 μL 3 mol/L醋酸钠，轻轻上下颠倒混匀；10 000×g离心5 min，弃上清；沉淀加入1 mL 4 ℃的75%乙醇，10 000×g离心5 min，弃上清；室温放置5 min，沉淀(即DNA)用30 μL ddH2O水溶解，-20 ℃保存备用。

1.4 聚合酶链式反应

以提取的DNA为模板，用引物PCV-2-F/R、PCV-3-F/R进行PCR扩增。PCR体系：2.5 μL DNA模板，1 μL dNTP Mixture(2.5 mmol/L)，2.5 μL 10 ×PCR Buffer，1 μL上游/下游引物(10 μmol/L)，0.3 μL Ex Taq(5 U/μL)，加DEPC处理的灭菌ddH2O至25 μL。反应程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸35 s，38个循环；72 ℃延伸7 min。扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测并观察结果。阳性PCR产物经胶回收后克隆至pMD18-T载体，转入TOP 10感受态细胞，菌液PCR鉴定后挑选阳性克隆送上海生工生物工程有限公司测序。

1.5 PCR特异性试验

应用建立的方法，以PCV-2、PCV-3、PRV、PDCoV、PEDV、TGEV、PRRSV及CSFV核酸为模板进行PCR扩增，扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测并观察结果。

1.6 PCR敏感性试验

将1.4中获得的阳性重组菌扩大培养后提取质粒，通过超微量分光光度计Nanodrop 2000测定提取的重组质粒的浓度，再根据重组质粒分子质量和阿伏伽德罗常数将质粒浓度换算成单位体积分子拷贝数，并将重组质粒稀释成1.0×108拷贝/μL的原始浓度后进行10倍梯度稀释，以1.0×108、1.0×107、1.0×106、1.0×105、1.0×104、1.0×103、1.0×102、1.0×101拷贝/μL为模板进行PCR扩增以检验建立的PCR方法的灵敏度。

1.7 PCR重复性试验

应用上述建立的双重PCR检测方法，选取同一阳性病料DNA为模板，每隔1周重复1次，检测3次，以确定检测方法的可靠性和重复性。

1.8 临床腹泻样品的检测

应用建立的RT-PCR方法检测2016—2017年从江西各地区猪场采集的265份疑似猪圆环病毒感染的病料组织中PCV-3和PCV-2存在情况。

2 结果与分析

2.1 双重PCR扩增结果

利用PCV-3和PCV-2的特异性引物分别对PCV-3和PCV-2进行PCR扩增，并对PCV-3和PCV-2进行双重PCR扩增，结果表明，单项PCR和多重PCR均能扩增出约408 bp和248 bp的片段(图1)，与预期结果一致。

2.2 PCR产物的克隆与测序分析

将扩增为PCV-3和PCV-2阳性的PCR产物回收、克隆后进行测序，将获得的序列与NCBI数据库序列进行BLAST比对分析；结果表明扩增得到的疑似PCV-2片段序列与KY806069、KU960929、KY305204毒株序列的同源性高达99%，扩增出的疑似PCV-3片段序列与KX778720、MF069116、KY075989、MF162299的同源性也为99%，证明所扩增的片段分别为PCV-3和PCV-2。

2.3 特异性试验

为检验建立的多重PCR方法的特异性，以PRV、PDCoV、PEDV、TGEV、PRRSV及CSFV核酸为模板，用所设计的引物进行RT-PCR/PCR扩增。结果发现(图2)，这些以非PCV-3和PCV-2为模板的样品均为阴性，只有PCV-2、PCV-3阳性病料可分别扩增出约为248 bp和408 bp的目的片段，表明该检测方法特异性良好。

1：PCV-3和PCV-2的双重PCR扩增产物；2：PCV-2单重PCR扩增产物；3：PCV-3单重PCR扩增产物；4：阴性对照；M：DNA Marker DL 20001:The amplification product of PCV-2 and PCV-3;2:The amplification product of PCV-2；3:The amplification product of PCV-3;4：Negative control;M:DNA Marker DL 2000图1 PCV-3和PCV-2单一和双重PCR扩增Fig.1 The single and dulex PCR products of PCV-3 and PCV-2

1：PCV-2单重PCR扩增产物；2：PCV-3单重PCR扩增产物；3：PCV-3和PCV-2双重PCR扩增产物；4～9：PRV、PDCoV、PEDV、TGEV、PRRSV、CSFV的扩增产物；10：阴性对照；M：DNA Marker DL 20001:The amplification product of PCV-2；2:The amplification product of PCV-3;3:The amplification product of PCV-2 and PCV-3;4-9：The PCR products of PRV、PDCoV、PEDV、TGEV、PRRSV and CSFV;10：Negative control;M:DNA Marker DL 2000图2 多重PCR特异性试验Fig.2 Validation of the specificity of the duplex PCR for PCV-2 and PCV-3 detection

2.4 敏感性试验

1-9：1.0×108～1.0×100拷贝/μL；10：阴性对照；M：DNA Marker DL 20001-9：1.0×108～1.0×100 copies/μL；10：Negative control；M：DNA Marker DL 2000图3 双重PCR敏感性试验Fig.3 Validation of the sensitivity of the duplex PCR

以重组质粒1.0×108拷贝/μL的原始浓度后进行10倍梯度稀释后作为模板，以检测所建立的双重PCR对PCV-3和PCV-2的最低检测量，发现两者的最低检测量均为1.0×103拷贝/μL(图3)。

2.5 重复性试验

利用建立的PCV-3和PCV-2双重PCR检测方法，以不同时间段连续扩增三次，结果表明(图4)，建立的方法具有较好的重复性。

2.6 临床样品检测

应用建立的PCR方法检测2016—2017年从江西各地区猪场采集的256份疑似猪圆环病毒感染的组织样品中的PCV-3和PCV-2感染情况。结果显示(图5)，PCV-2的阳性率较高，为86.3%(221/256)；2份样品为PCV-3阳性，阳性率为0.78%；其中1份PCV-3和PCV-2混合感染，混合感染率为0.39%。

A、B和C分别代表第一、二和三周的PCR；1：PCV-2；2：PCV-3；3：PCV-3和PCV-2；4：阴性对照；M：DNA Marker DL 2000A,B and C:The first,second and third week of PCR,respectively;1:PCV-2;2:PCV-3;3:PCV-2 and PCV-3;M:DNA Marker DL 2000图4 双重PCR的重复性试验Fig.4 Validation of the repeatability of the duplex PCR

1-24：部分临床样品双重PCR检测结果；M：DNA Marker DL 20001-24:PCV-2 and PCV-3 PCR results of representative samples of pig;M:DNA Marker DL 2000图5 部分临床样品PCR检测Fig.5 PCR results of representative diarrheal samples of pigs

3 结论与讨论

PCV-3是近年来新发现的圆环病毒亚型，可引起母猪繁殖障碍、流产，可感染公猪，并通过精液传播等，是猪群新现的重要病原[12-13]。目前，PCV-3仅在皮炎肾病综合征的母猪、流产胎儿及公猪精液中检测出来[12]。因此，本研究针对临床上有类似症状发病死亡的猪只，建立双重PCV-3和PCV-2 PCR的检测方法，为临床上同时诊断、流行病学调查这两种病原提供一种切实可行的技术手段。目前，尚未有同时检测PCV-3和PCV-2 PCR的检测方法，仅有高通量测序和单一病原的检测手段[7-8]。随后我国学者Shen和Ku也在中国的猪群中发现了该亚型病毒的存在，并建立了PCV-3的PCR检测方法，最低检测核酸含量为20.5 pg，且与其他猪源病毒无交叉反应。传统的诊断病毒的方法有间接ELISA、免疫组织化学、病毒分离等[13,14-17]，前者需要制备特异性抗体，后者需要寻找易感细胞和合适的培养条件，试验周期均较长，不适合新发病原的监控。而所建立的双重PCR检测方法，可以一次反应检测出PCV-3和PCV-2两种病毒，最低检测量为103拷贝/μL，特异性高，可快速、简便对临床样品进行检测及流行病学调查。

利用建立PCV-3和PCV-2双重PCR的检测方法对实验室收集的256份样品，PCV-3和PCV-2单独感染率各为86.3%和0.39%，混合感染率为0.39%。Ku等[12]报道的通过普通PCR从辽宁、重庆3个猪场中的222份样品中发现，PCV-3和PCV-2单独感染率各为62.2%和34.7%，混合感染率为15.8%，和本研究的PCV-3的检出率相差较大，可能是因为采样地区的局限性。对于PCV-3和PCV-2的感染情况，追溯PCV-3来源和各毒株之间的关系，以及对该病毒的分离、致病性研究，仍是目前急需开展的工作，这也有助于防控PCV-3和PCV-2对猪群造成的危害。

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