山东银莲花组织培养植株再生体系的建立

陈春利， 顾德政， 刘 毓， 孟清秀， 李可勤

(1.山东农业工程学院，山东济南 250100； 2.济南市花卉研究所，山东济南 250100)

山东银莲花[Anemoneshikokiana(Makino) Makino]是毛莨科(Ranunculaceae)银莲花属(Anemone)植物朝鲜银莲花(Anemonechosenicola)的变种[1]，属于多年生草本植物，特产于山东东部，以崂山、昆嵛山为分布中心，常生于海拔500 m以上的山坡草丛及阴湿林下，崂山之崂顶及昆嵛山之泰礴顶附近草丛中常见其生长[2]。海拔、生境等对其分布具有一定的影响，因此其分布极其狭窄，属于典型的稀有物种，由于崂山、昆嵛山两地均为旅游景区，山东银莲花的生境破坏严重，使得该物种更加稀有[3]。山东银莲花为我国的特有种质资源，国外还未见相关研究报道，而国内目前对其报道也很少，最早可见的报道是臧得奎等在1999年对山东特有野生花卉进行的初步研究[2]。2011年，徐晓艳等对山东银莲花种子萌发特性进行了研究[4]。2014年，王鸷等对山东银莲花的分布格局及影响因子进行了分析[1]，刘琼从基因分化水平研究山东银莲花的遗传多样性[5]。关于山东银莲花引种驯化、组织培养、药用价值的研究至今未见报道。为此，实现对山东银莲花的应用，需要开展相应的人工栽培研究，而人工栽培的关键在于解决山东银莲花种苗繁殖问题。本试验以山东银莲花幼嫩茎段为外植体，拟构建稳定的植株再生体系，并探讨几个相关影响因素，以期为山东银莲花的快速繁殖、遗传多样性研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 植物材料的获取

2015年10月于昆嵛山泰礴顶，剪取山东银莲花带饱满顶芽的幼嫩茎段，用瓶装水冲洗后装入保温杯内。

1.2 材料消毒

取山东银莲花带顶芽幼嫩茎段，用毛笔蘸洗衣粉水轻轻刷洗其表面灰尘，然后放入干净的容器中，在流水下冲洗1～2 h，再用0.5%多菌灵粉剂浸泡15 min，随后用蒸馏水冲洗 3～10次，最后用无菌吸水纸吸干外植体表面的水分。

外植体灭菌：将处理完的茎段转移至三角瓶中，在超净工作台内先用75%乙醇消毒30 s，之后用无菌水冲洗3次，然后用1% NaClO分别处理10、20、25 min，再用0.1% HgCl2分别处理8、10、13 min，在灭菌过程中滴加1～3滴吐温并充分摇晃三角瓶，使杀菌剂与外植体充分接触，最后用无菌水冲洗 6～10次，将长为1～2 cm的茎段接种到含有0.2 mg/L 6-BA 的MS启动培养基中。每个培养瓶中接种1个外植体，每个处理接种30瓶，重复3次，7 d后观察外植体的灭菌及生长情况，并统计各处理间的污染率、褐化率、存活率。

1.3 继代与增殖培养

以MS为基本培养基，分别添加植物生长调节剂6-苄氨基腺嘌呤(即6-BA，浓度设为0.5、1.0、1.5 mg/L)、α-萘乙酸(即NAA，浓度设为0.00、0.05、0.20 mg/L)、赤霉酸(即GA3，浓度设为0.00、0.05、0.20 mg/L)作为愈伤组织的诱导培养基。然后将消毒后的外植体接种于上述培养基上培养，每个处理30株苗，重复3次，30 d后统计增殖系数。

1.4 生根培养与移栽

取株高已达2 cm以上的丛生芽，在无激素的MS培养基中壮苗培养20 d，再接入1/2MS生根培养基中进行培养。生根培养基采用3因素3水平正交试验设计，各因素分别为NAA(浓度设为0.0、0.5、1.0 mg/L)、吲哚丁酸(即IBA，浓度设为0.0、5.0、10.0 mg/L)、蔗糖(浓度设为25、30、35 g/L)。每个处理30株苗，重复3次。

待组培苗生长至10 cm左右时，开盖后炼苗1周，然后将完整的再生植株移栽于蛭石、珍珠岩、草炭体积比=1 ∶2 ∶2的基质中(高压灭菌)，并保持适宜温度和湿度，隔天浇1次水。

1.5 培养条件

将培养室的温度恒温保持在(25±1) ℃，愈伤组织分化和植株再生阶段的光照度为50 μmol/(m2·s)，光照时间为16 h/d。

1.6 统计分析方法

试验数据使用DPS 9.50、SPSS 18.0进行方差分析和显著性分析，用Excel 2003制表。观测变量的计算公式如下：

增殖系数=新增殖的芽数/接种芽的总数；

污染率=(污染的外植体数/接种外植体的总数)×100%；

褐化率=(褐化的外植体数/接种外植体的总数)×100%；

存活率=(存活的外植体数/接种外植体的总数)×100%；

生根率=(生根的组培苗数/接种组培苗的总数)×100%；

诱导率=(诱导分化的外植体数/存活外植体的总数)×100%；

移栽成活率=(移栽存活的组培苗数/移栽组培苗的总数)×100%。

2 结果与分析

2.1 外植体灭菌方法的选择

将经过消毒处理的山东银莲花茎段接种到培养基上培养7 d后，统计污染率、褐化率和存活率。由表1可以看出，用1% HgCl2消毒处理的外植体污染率极显著低于1% NaClO处理，但褐化率极显著高于1% NaClO处理。1% HgCl2处理10 min的外植体存活率最高，达到35.93%。1% HgCl2各处理间差异整体不显著，但与1% NaClO处理10、20 min之间差异极显著。通过上述多重比较，综合分析不同消毒处理对外植体污染率、褐化率及存活率的影响可知，1% HgCl2处理 10 min 为适合山东银莲花茎段外植体的最佳消毒处理方法。

表1 不同消毒处理对山东银莲花茎段外植体污染率、褐化率及存活率的影响

2.2 增殖培养

将消毒好的外植体分别接种于添加不同种类和浓度植物生长调节剂的MS培养基上培养，30 d后统计增殖系数。由表2可知：6-BA、NAA、GA33种培养因素对山东银莲花组培苗增殖系数的影响程度差异很大，其中6-BA对增殖系数的影响最大，与其他处理间差异明显。其次是GA3、NAA处理。对6-BA的各个水平间进行多重比较发现，添加0.5、1.0 mg/L 6-BA与添加 1.5 mg/L 6-BA处理间存在极显著差异，而添加0.5、1.0 mg/L 6-BA水平之间差异不显著；添加GA3的组培苗与不添加的相比更加纤弱，苗不够健壮，且有茎尖和叶片枯死现象。由此可见，最佳的增殖培养基为 MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA。

从试验观察结果看，6-BA的浓度与山东银莲花的褐化程度密切相关，随着浓度的增加，褐化程度加剧，当6-BA的浓度达到1.5 mg/L时，更易导致组培苗的褐化，可能是由于6-BA能促进酚类化合物的合成或者是刺激多酚氧化酶活性的提高。因此综合分析确定MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+25 g/L蔗糖+6 g/L琼脂为山东银莲花的最佳增殖培养基，结果显示，30 d时增殖系数为3.43。山东银莲花组培苗的增殖状况见图1、图2。

2.3 生根与移栽

2.3.1 生根培养基的筛选 将经过壮苗培养30 d、株高达 2 cm以上的健壮山东银莲花组培苗植株转接入含有不同浓度植物生长调节剂、蔗糖的培养基及基本培养基中进行生根培养。由表3可以看出：3种因素对山东银莲花组培苗生根率的影响程度差异很大，其中IBA对生根率的影响最大，其次是NAA和蔗糖处理，且IBA的各个水平间差异均达到了极显著水平。因此可以得出，适合山东银莲花组培苗的最佳培养基为1/2MS+10.0 mg/L IBA+35 g/L蔗糖+6 g/L琼脂。

表2 植物生长调节剂对山东银莲花组培苗增殖培养的影响

2.3.2 驯化移栽 移栽基质的成分对组培苗的成活有很大影响，与组培苗能否移栽成活直接相关。由表4可知，在处理5培养基(珍珠岩、蛭石、草炭体积比=1 ∶2 ∶2)上生长的组培苗较处理3、处理4 2种基质成活率高，为83.36%，达到极显著水平，而在处理2培养基(珍珠岩、蛭石、草炭体积比=0 ∶1 ∶1)上生长的组培苗成活率最低。山东银莲花组培苗的最佳移栽基质配比为珍珠岩、蛭石、草炭体积比=1 ∶2 ∶2。山东银莲花组培苗的生根与移栽状况见图3。

表3 植物生长调节剂及蔗糖对山东银莲花组培苗生根的影响

表4 不同比例的移栽基质对山东银莲花组培苗移栽成活率的影响

3 讨论

3.1 外植体的选择及灭菌

选择合适的外植体是植物组织培养成功的关键因素之一，一般在自然条件下生长势旺的植物种类更容易建立组培快繁体系，且易分化、增殖；而在自然条件下繁殖较慢的品种进行离体培养的繁殖系数相对较小。山东银莲花是典型的山东省稀有植物物种，对生存环境的要求较为苛刻，在自然条件下生长缓慢，抗逆性差，因而较难建立组培快繁体系。此外，山东银莲花组织培养中材料的大小选择也十分重要，材料太大容易污染，材料太小，难以成活。因此，一般选取的材料长度为0.5～1.0 cm左右。

山东银莲花的带顶芽茎段由于直接暴露在土壤和空气中，且有鳞片包被，其芽体和芽体内部易积累污染物，因此消毒灭菌困难，只有选择合适的灭菌剂和灭菌方法，才能有效建立起无菌体系，一般植物组织培养中常用的消毒剂有次氯酸钠、次氯酸钙、氯化汞等，在本试验中，HgCl2消毒的整体效果要远远好于采用NaClO的消毒效果，但是山东银莲花外植体接种后会出现不同程度的褐化，随着HgCl2浓度的提高，其褐化程度也在不断加大，因而山东银莲花外植体的最佳灭菌方法是用75%乙醇消毒30 s，再用无菌水冲洗3次，然后用0.1% HgCl2处理10 min，最后用无菌水冲洗6次，接种后可获得较低的污染率和最高的存活率。

3.2 不同植物生长调节剂对组培器官发生的影响

植物生长调节剂对于培养物的生长尤其是形态建成起着极其重要而明显的作用，植物自身的生长调节物质的种类和浓度调节着细胞分化、伸长的启动，并调节愈伤组织生长以及根、芽的分化和发育。但是外源激素必须通过植物体内的内源激素水平来起作用，因此，外植体形态发生的诱导和调节是通过多种激素的相互平衡以及协同来共同实现的。

6-BA是目前植物组培研究中常用的一种细胞分裂素，能够有效诱导植物的分化再生，本研究表明，6-BA对组培苗增殖的影响极显著，起到了决定性作用，6-BA和NAA配合使用可以获得较高的增殖系数。试验观察结果表明，6-BA 浓度与山东银莲花的褐化程度密切相关，随着浓度增加，褐化程度加剧，当6-BA浓度达到1.5 mg/L时，更易导致组培苗的褐化，原因可能是6-BA能促进酚类化合物的合成或者是刺激多酚氧化酶活性的提高。一些植物在组培中添加GA3可促进茎生长、提高增殖系数，但有时会导致茎尖和叶片枯死，建议间断使用。本研究添加一定浓度的NAA或GA3均取得了类似的效果。添加GA3的组培苗与不添加的相比更加纤弱，组培苗不够健壮，且有茎尖和叶片枯死现象。因此，综合分析确定MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+25 g/L蔗糖+6 g/L琼脂为山东银莲花的最佳增殖培养基。

3.3 生根培养

在生根培养过程中，大量的研究表明，起主导作用的是生长素，不同类型的生长素对组培苗的生根诱导差异比较明显。本试验中植物激素的添加对山东银莲花组培苗生根率的影响程度差异很大，单独添加IBA、NAA均能诱导山东银莲花组培苗不定根的产生，但添加IBA的生根效果明显好于添加NAA的生根效果，添加NAA诱导出的根多为愈伤根系，而且分化出的根粗大，生长异常，根系脆弱，一碰就断，移栽时难以成活，组培苗经过IBA诱导出的根系不经过愈伤组织，从组培苗的基部直接发生，而且根系的生长发育状况好，根系健壮，从而移栽成活率高。因此在本试验中得出适合山东银莲花组培苗的最佳培养基为1/2MS+10.0 mg/L IBA+35 g/L 蔗糖+6 g/L琼脂。

4 结论

本研究以山东银莲花幼嫩茎段为外植体，分析了外植体消毒和不同激素配比对增殖、生根培养的影响，成功建立了其组织培养植株再生体系。结果表明，1% HgCl2处理10 min可以降低外植体污染率、褐化率，存活率较高；最佳增殖培养基为MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+25 g/L蔗糖+6 g/L琼脂；最佳生根培养基为1/2 MS+10.0 mg/L IBA+35 g/L 蔗糖+6 g/L琼脂；最佳组培苗移栽基质配比为珍珠岩、蛭石、草炭体积比为1 ∶2 ∶2。从外植体培养到植株再生共需16周左右。山东银莲花组培再生体系的建立为进一步探讨其遗传多样性奠定了基础。