珍珠层作为天然骨移植替代物的研究进展

程亚楠 徐 普

珍珠层是位于双壳类、腹足类与头足类等软体动物贝壳的内层部分，来源广泛，由有机基质与碳酸钙耦合构成。体内与体外实验研究发现珍珠层具有骨诱导性、骨传导性、生物相容性和生物降解性。凭借其有竞争力的价格成本、化学复杂性及出色的机械性能等特性，珍珠层被视为一种可以用作骨移植替代物的天然生物材料。本文系统回顾近年来国内外关于珍珠层研究的体内与体外实验，以及珍珠层作为骨移植替代物的潜在作用。

一、珍珠层

1.物理结构：生物组织具有直接影响其力学性能的复杂纳米、微米尺度结构。在微观尺度上，珍珠层是由六方晶系文石板片通过层间有机基质排列而成的连续平行的薄片组成，其典型结构是一种规则的“砖墙结构”；在纳米尺度上，文石板片本身是由六方晶系的文石结晶颗粒及覆盖并嵌入其中的有机基质颗粒组成的复合材料[1～3]。珍珠层由于独特的层状微结构与构成特点表现出比骨更优异的抗压性能。珍珠层的杨氏模量为30～40GPa，而骨的杨氏模量为20GPa，珍珠层与骨的耐挠屈破坏性值分别为 185～200MPa 和 140MPa[4，5]。

2.化学成分：珍珠层无机成分（占珍珠层总质量的97%）由文石型碳酸钙组成，有机部分（占珍珠层总质量的3%）是由蛋白质、多肽、糖蛋白、壳多糖等组成的混合物[6]。迄今为止，来自珍珠层的50多种蛋白质和50种多肽已经被鉴定（UniProt蛋白数据库），珍珠层内的有机分子可用水和有机溶剂萃取[7，8]。

二、对骨移植替代物的临床要求

骨移植主要有三种类型：自体骨、同种异体骨和骨移植替代物。自体骨移植和同种异体骨移植存在手术时间延长、个性化塑形困难与疾病传播等缺点，使其应用受到极大限制[9，10]。因此，对骨移植研究的重点转变为对各种骨移植替代物的研究[11]。由于创伤、感染与肿瘤等导致的不同部位的骨丢失应该有不同的处理方法。临床上选择骨移植替代物主要取决于以下因素[12]：缺损大小与骨移植物需求量；预期临床应用效果；生物力学性质；化学组成；理想的生物活性（骨传导性、骨诱导性、成骨能力）；理想的降解率；处理特性；相关的副作用；成本与伦理等问题。

迄今为止，还没有一种理想的骨移植替代物，能够满足所有临床需求。为了满足骨移植替代物的主要要求，引入了4Fs法则，即形态、功能、固定和形成[11]。形态意味着骨缺损腔能够被骨移植替代物所填充；功能是指骨移植替代物的承重性能；固定是需要移植材料牢固地附着在骨缺损边缘，消除宿主骨和材料之间的动度，以避免不连接或形成假性关节；形成是指移植材料能够促进骨形成。对于骨移植替代物，颅外科手术则有更多关于形态的要求；而矫形外科手术，特别是有严重骨折或肢体重建的情况，对功能和固定要求更高；此外，口腔颌面外科与牙科手术对移植物也有不同的要求。

三、目前骨移植替代物研究的主流思路和主要困境

目前合成骨移植替代物研究的重点旨在改善其潜在的成骨性、骨传导性和骨诱导性。成骨性（骨生成）意味着骨移植替代物本身含有骨形成细胞，能够形成骨基质。骨传导性是指移植物可以引导前体成骨细胞及骨细胞在其表面或其内部的孔隙与管道中生长[13]。骨诱导性是指可以从周围的组织募集未分化的间充质干细胞并刺激这些细胞发育成为具有骨再生能力的前成骨细胞，分泌骨基质形成新骨[13，14]。

尽管在过去20年中，已经发表了超过21000篇关于骨移植替代物的报道，但是由于一些无法规避的限制与挑战，骨移植替代物并没有全部应用于临床实践[11，12，15～17]。目前骨移植替代物发展面临的最难解决的问题是：①制备高机械强度的多孔支架并保持适当的血管化和宿主整合性质；②评估大型负重动物模型中的移植功能；③调整宿主异物反应；④评估制造过程的技术难点、效率、成本和植入前期的安全风险；⑤满足特定的市场需求。

四、关于珍珠层的体内实验

Lopez等人在1992年发现珍珠层同时具有生物相容性和骨诱导性[18]。随后，针对珍珠层的成骨特性，国内外科研工作者们开展了大量广泛而深入的研究。在过去的20年中，珍珠层被设计的更加巧妙，并进行了在各种不同植入部位与不同用途的体内实验，植入部位涉及上颌骨、下颌骨、股骨等[19～23]。在人类、大鼠、羊、兔和猪的体内实验中均观察到由珍珠层诱导的新骨形成[19，20，24～26]。

1.珍珠层的生物相容性、骨传导性、骨诱导性与骨结合：Atlan等[19]将珍珠层粉与自体血的混合物分别注射到8名女性患者的上颌前磨牙区骨缺损部位，术后6个月的活检结果显示珍珠层耐受良好，与新生骨组织形成紧密结合，没有任何软组织或纤维组织的干预，珍珠层粉逐渐向心性生物溶解，并被未成熟的编织骨取代，然后改建为成熟的板层骨，该研究结果表明珍珠层具有良好的生物相容性和成骨特性，随后的体内实验进一步证实了Atlan等的研究成果[27，23]。

2.珍珠层与其他骨移植材料之间的比较：Asvanund等[20]通过外科程序在10只雄性豚鼠双侧下颌骨制备骨缺损，其中8只豚鼠骨缺损区分别植入棒状珍珠层（2×2mm）与β-磷酸三钙颗粒（β-TCP），另外2只豚鼠进行假手术处理，术后30、60d的下颌骨脱钙组织切片azan染色显示：骨缺损区填充材料有助于牙槽骨再生，而珍珠层组相较于β-TCP组与假手术组显示出更大量的新骨形成，同时也发现在β-TCP组和假手术组的下颌骨缺损部位的中心区域有一些纤维组织填充空间，他们的研究结果表明了珍珠层用作骨移植替代材料的可行性。Lamghari等[23，27，28]也进行了珍珠层粉和聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）在羊椎骨中的比较，在羊腰椎中制备实验腔，分别填充可注射型珍珠层粉、PMMA和脂肪组织（对照组），分别于术后1、8、12w取材制备椎骨切片行组织学和形态学测定，结果发现：对照组与PMMA组均无新骨形成，而在珍珠层粉组，可以观察到在尚未完全降解的珍珠层粉周围存在由不同成熟阶段的编织状骨和层状骨构成的骨层，证实了早期研究结果[19]。Lamghari等[26]进行了珍珠层与自体骨移植物在兔腰椎横突间融合模型中的成骨作用实验研究，分别使用珍珠层粉与自体血的混合物及自体髂嵴骨进行关节固定术，对照为假手术组。术后2w显示珍珠层耐受性良好；术后5w观察到在珍珠层颗粒降解的区域内有软骨内成骨；术后11w组织学研究发现在珍珠层与自体骨植入的部位仍存在新骨形成，而在假手术组，无新骨形成。

3.珍珠层的生物降解性：材料自身的生物降解机制是选择植入材料的一个重要参考因素[24]。珍珠层植入物的形状与植入位置是影响其降解性的两个重要因素。当珍珠层以片状形式植入时，在术后10个月仍能观察到珍珠层的存在，在骨/珍珠层界面没有观察到破骨细胞或骨吸收[23，29，30]。将珍珠层加工成粉末状（粉末粒度为50～150um）植入到兔椎骨中，术后8w显示珍珠层粉逐渐降解[19]，没有观察到多核巨细胞或巨噬细胞[31]。以上研究结果在人类上颌骨、大鼠股骨的体内实验中得到证实[19，24]。上述实验结果表明珍珠层的降解过程破骨细胞并未参与，可能更多的是物理化学溶解[24]，但是在上述实验结束时总是观察到一些珍珠层粉残留。随后的研究发现，珍珠层/骨表面的变化速度还取决于骨内植入部位与珍珠层/骨相互作用[32]，分别在术后3、6和9个月分析骨/珍珠层与骨髓/珍珠层界面，结果显示，面对骨髓的珍珠层表面总是比植入矿化骨部位时更不规则，珍珠层界面的变化似乎是植入位置依赖性的而不是时间相关性的。总之，珍珠层的体内生物降解取决于植入物的大小、形状与植入部位，是一个高度可变的参数。珍珠层块生物降解有限，在骨再生与骨重塑期间会持续存在，而粉末状珍珠层降解速度较快，若珍珠层粉颗粒足够精细，可以在短时间内完全降解。

五、关于珍珠层的体外实验

由于珍珠层在体内具有骨诱导作用，显示了作为骨移植替代物所该具有的诸多优秀品质，所以体外实验的研究重点是明确其成骨机制及在成骨过程中发挥作用的信号因子。

1.珍珠层复合物与成骨作用相关的成分：在没有任何化学诱导剂添加的情况下，珍珠层可以诱导人成骨细胞体外矿化，且珍珠层片周围的成骨细胞会优先矿化，表明珍珠层具有生物相容性、骨诱导性和骨传导性[18]。其他学者也进行了相似的研究[33，34]。Silve等评估了骨和珍珠层同时存在时对人成骨细胞的影响，结果表明珍珠层对成骨细胞有明显的促成骨作用，通过现有骨的生长以及邻近植入物基质内形成矿化结节发生新骨形成[33]，体内研究中观察到的结果也证实了这种现象[19]。以上实验结果表明，珍珠层中的确含有信号因子，当把它放置在培养基时这些信号因子会释放出来。这些信号因子可能存在于珍珠层水溶性基质（water soluble matrix，WSM）中，WSM能够增加前成骨细胞骨分化标记物—碱性磷酸酶、胶原蛋白I与骨钙素的表达量，还能够诱导骨矿化结节的形成[34，35]。有学者认为从WSM内提取的p10、p60和PFMG3蛋白可以诱导小鼠前成骨细胞分化[36～38]，也有学者认为在成骨细胞分化中发挥作用的珍珠层分子可能更多的与多肽有关[39，40]。最近有学者提出珍珠层醇溶性基质在MC3T3-E1细胞和人类骨关节炎成骨细胞中具有类似的骨诱导作用[8，41]。

2.珍珠层的生物降解性：有学者认为珍珠层可以诱导破骨细胞前体分化为能够吸收珍珠层的破骨细胞，但是珍珠层的吸收效率始终低于骨，并且吸收时间似乎是有限的[42]。而其他学者认为珍珠层的体外降解与WSM通过阻止上调活化T细胞胞质的核因子1（NFATc1）抑制破骨细胞形成有关[43]。因此，珍珠层由破骨细胞介导的体外降解是有限的。

六、结论与展望

现有的研究结果表明珍珠层可以加工成不同的形状用于[44]：①承重部位的骨缺损区以提供机械支撑，例如主要长骨和颚骨缺陷处；②填充无负荷部位的大面积骨缺损，例如颅骨缺损；③当采取开放性解剖术时，珍珠层也可用于促进椎间融合。珍珠层还可作为注射型材料用于某些微创手术，注射型珍珠层粉可能比珍珠层片或珍珠层块有更好的市场前景，用于填补由囊肿或良性肿瘤引起的半封闭性骨缺损。也可以将珍珠层添加到其他移植材料中用以提高材料的骨诱导性和骨传导性。此外，可以利用3D打印技术将珍珠层粉和/或其他原料制作成个性化的植入物用于骨缺损区[45]。珍珠层提取物也可以用作不同骨移植替代物的表面涂层材料，通过刺激成骨细胞活化、抑制破骨细胞活性来提高骨诱导能力[46]。到目前为止，似乎没有一种完美的骨修复材料，珍珠层作为一种天然海洋生物材料，具有低成本、低免疫原性、低细胞毒性、潜在生物学功能、易于安全储存等诸多优点[47]，有望成为一种理想的骨移植替代材料。

1 武涵，杨磊，欧阳茜茜，等.流沙湾海水养殖珍珠微观结构及形成机制研究.电子显微学报，2017，36（2）：154-159.

2 李倩，张恩，涂晓琼.海水养殖珍珠光泽与其微结构的关系.矿物学报，2016，36（2）：226-229.

3 Samir H，Noureddine S，Zitouni A，et al.Structural and mechanical properties of the coral and nacre and the potentiality of their use as bone substitutes.Applied Surface Science，2013，264：485-491.

4 Currey JD，Zioupos P，Peter D，et al.Mechanical properties of nacre and highly mineralized bone.Proc Biol Sci， 2001，268（1462）：107-111.

5 Song F，Soh AK，Bai YL.Structural and mechanical properties of the organic matrix layers of nacre.Biomaterials，2003，24（20）：3623-3631.

6 Gerhard EM，Wang W，Li C，et al.Design strategies and applications of nacre-based biomaterials.Acta Biomater，2017，54：21-34.

7 Laothumthut T，Jantarat J，Paemanee A，et al.Shotgun proteomics analysis of proliferating STRO-1-positive human dentalpulp cell after exposure to nacreous water-soluble matrix.Clin Oral Investig，2015，19（2）：261-270.

8 Zhang G，Willemin AS，Brion A，et al.A new method for the separation and purification of the osteogenic compounds of nacre ethanol soluble Matrix.J Struct Biol，2016，196（2）：127-137.

9 Pierannunzii L，Zagra L.Bone grafts， bone graft extenders，substitutes and enhancers for acetabular reconstruction in revision total hip arthroplasty.EFORT Open Rev， 2017， 1（12）：431-439.

10 曹帅帅，周苗，Pedro Miranda，等.三维打印β-TCP颌骨修复支架的生物学评价.口腔医学研究，2017，33（7）：712-716.

11 Hollister SJ，Murphy WL.Scaffold translation：barriers between concept and clinic.Tissue Eng Part B Rev， 2011， 17（6）：459-474.

12 Brydone AS，Meek D，Maclaine S.Bone grafting，orthopaedic biomaterials，and the clinical need for bone engineering.Proc Inst Mech Eng H，2010，224（12）：1329-1343.

13 汪安，陈建荣，于丽凤，等.生物吸收性多孔碳酸化羟基磷灰石支架的骨传导性体外研究.口腔颌面外科杂志，2014，24（3）：185-191.

14 Ozdemir T，Higgins AM，Brown JL.Osteoinductive biomaterial geometries for bone regenerative engineering.Curr Pharm Des，2013，19（9）：3446-3455.

15 Amini AR，Laurencin CT，Nukavarapu SP.Bone tissue engineering：Recent advances and challenges.Crit Rev Biomed Eng，2012，40（5）：363-408.

16 O’Keefe RJ，Mao J.Bone tissue engineering and regeneration：from discovery to the clinic-an overview.Tissue Eng B Rev，2011，17（6）：389-392.

17 冯婧，公柏娟，李志民，等.骨组织工程支架材料及其表面修饰的研究进展.医学综述，2017，23（12）：2374-2379.

18 Lopez E，Vidal B，Berland S，et al.Demonstration of the capacity of nacre to induce bone formation by human osteoblasts maintained in vitro.Tissue Cell，1992，24（5）：667-679.

19 Atlan G，Balmain N，Berland S，et al.Reconstruction of human maxillary defects with nacre powder：histological evidence for bone regeneration.C R Acad SciIII， 1997， 320（3）：253-258.

20 Asvanund P，Chunhabundit P.Alveolar bone regeneration by implantation of nacre and B-tricalcium phosphate in guinea pig.Implant Dent，2012，21（3）：248-253.

21 庞永志，胡温庭，彭凤梅.复方白芨胶/珍珠层粉修复兔牙槽骨缺损的实验研究.山东大学学报（医学版），2013，51（1）：37-41.

22 陈灵，徐普，陈明炜，等.纳米级淡水珍珠粉修复兔股骨远端缺损的体内研究.现代口腔医学杂志，2017，31（1）：15-18.

23 Pascaretti-Grizon F，Libouban H，Camprasse G，et al.The interfacebetween nacre and bone afterimplantation in the sheep： a nanotomographic and raman study：bone-nacre interface.J Raman Spectrosc，2014，45：558-564.

24 Liao H， Mutvei H，Sjöström M，et al.Tissue responses to natural aragonite （Margaritifera shell） implants in vivo.Biomaterials，2000，21（5）：457-468.

25 Rousseau M，Delattre O，Gillet P，et al.Subchondral nacre implant in the articular zone of the sheep's knee：a pilot study.Biomed Mater Eng，2012，22（4）：227-234.

26 Lamghari M，Antonietti P，Berland S，et al.Arthrodesis of lumbar spine transverse processes using nacre in rabbit.J Bone Miner Res，2001，16（12）:2232-2237.

27 LamghariM， HuetH， LaurentA， etal.A modelfor evaluating injectable bone replacements in the vertebrae of sheep：radiological and histological study.Biomaterials， 1999，20（22）：2107-2014.

28 Lamghari M，Berland S，Laurent A，et al.Bone reactions to nacre injected percutaneously into the vertebrae ofsheep.Biomaterials，2001，22（6）：555-562.

29 Camprasse G，Camprasse S，Gill GA.Substitution of the dental root by aquatic invertebrate skeletons in animals and man.C R Acad Sci III，1988，307（8）：485-491.

30 Camprasse S，Camprasse G，Pouzol M，et al.Artificial dental root made of natural calcium carbonate（Bioracine）.Clin Mater，1990，5（2-4）：235-250.

31 Lamghari M，Almeida MJ，Berland S，et al.Stimulation of bone marrow cells and bone formation by nacre：in vivo and in vitro studies.Bone，1999，25（2 Suppl）：91S-94S.

32 Berland S，Delattre O，Borzeix S，et al.Nacre/bone interface changes in durable nacre endosseous implants in sheep.Biomaterials，2005，26（15）：2767-2773.

33 Silve C，Lopez E，Vidal B，et al.Nacre initiates biomineralization by human osteoblasts maintained in vitro.Calcif Tissue Int，1992，51（5）：363-369.

34 Chaturvedi R，Singha PK，Dey S.Water soluble bioactives of nacre mediate antioxidant activity and osteoblast differentiation.PLoS One，2013，8（12）：e84584.

35 Green DW，Kwon HJ，Jung HS.Osteogenic potency of nacre on human mesenchymal stem cells.Mol Cells，2015，38（3）：267-272.

36 Zhang C，Li S，Ma Z，et al.A novel matrix protein p10 from the nacre of pearl oyster （Pinctada fucata） and its effects on both CaCO3crystalformation and mineralogenic cells.Mar Biotechnol（NY），2006，8（6）：624-633.

37 Lao Y，Zhang X，Zhou J，et al.Characterization and in vitro mineralization function of a soluble protein complex P60 from the nacre of pinctada fucata.Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol，2007，148（2）：201-208.

38 Wang X，Liu S，Xie L，et al.Pinctada fucata mantle gene 3（PFMG3） promotes differentiation in mouse osteoblasts（MC3T3-E1）.Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol，2011，158（2）：173-180.

39 Rousseau M，Boulzaguet H，Biagianti J，et al.Low molecular weight molecules of oyster nacre induce mineralization of the MC3T3-E1cells.J BiomedMaterRes A， 2008， 85（2）：487-497.

40 Rousseau M，Pereira-Mouriès L，Almeida MJ，et al.The water-soluble matrix fraction from the nacre of Pinctada maxima produces earlier mineralization of MC3T3-E1 mouse pre-osteoblasts.Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol，2003，135（1）：1-7.

41 Brion A，Zhang G，Dossot M，et al.Nacre extract restores the mineralization capacity of subchondral osteoarthritis osteoblasts.J Struct Biol，2015，192（2）：500-509.

42 Duplat D，Chabadel A，Gallet M，et al.The in vitro osteoclastic degradation of nacre.Biomaterials，2007，28（12）：2155-2162.

43 Kim H，Lee K，Ko CY，et al.The role of nacreous factors in preventing osteoporotic bone loss through both osteoblast activation and osteoclastinactivation.Biomaterial， 2012， 33（30）：7489-7496.

44 Zhang G，Brion A，Willemin AS，et al.Nacre，a natural，multi-use，and timely biomaterial for bone graft substitution.J Biomed Mater Res A，2017，105（2）：662-671.

45 郑志平，毛小泉.珍珠层粉复合支架修复骨缺损的生物学性能研究.天然产物研究与开发，2017，29：172-175，90.

46 Curran D， MaravicM， KieferP， etal.Epidemiologyof osteoporosis-related fracturesin France：a literature review.Joint Bone Spine，2010，77（6）：546-551.

47 Green D，Lai WF，Jung HS.Evolving marine biomimetics for regenerative dentistry.Mar drugs，2014，12（5）：2877-2912.