正交设计优化柠檬酸提取蓝莓花青素工艺

陈海龙+高晓辉+翟丹云+赵莉莉+李赟+杨晓丽+董延虎

摘要：以蓝莓为原料，蓝莓花青素含量为指标，在单因素试验基础上，采用正交试验设计法优化柠檬酸提取蓝莓花青素的工艺。验证试验确定了柠檬酸提取蓝莓花青素最佳提取工艺，即柠檬酸浓度为30%，料液比（g/mL）为1∶15，提取温度为50 ℃，提取时间为90 min。在最优工艺下花青素含量为3.62 mg/g。

关键词：蓝莓；花青素；柠檬酸；正交试验法

中图分类号：TQ914 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）24-4859-04

蓝莓为杜鹃花科多年生灌木，其果实呈深蓝色，被白霜，含有丰富的花青素和维生素等活性成分[1]。花青素与糖以糖苷键结合而形成花青素，作为一种天然色素分布广泛，存在于许多水果中，如紫薯、葡萄、桑甚、蓝莓等。研究发现，经常食用花青素可明显改善视力、减缓老年斑的沉积、促进心肺等功能[2，3]，且能延缓皮肤衰老，有效预防感染性疾病和降低早期奥本海默症状的患病风险，对由糖尿病引起诸多疾病有辅助治疗作用[4，5]。因为花青素具有明显的保健功效，使得富含花青素的原料被作为营养加强剂添加到食品中[6，7]。蓝莓富含花青素，可作为药食两用水果进一步开发成具有降血脂的保健食品和药品[8]。提取蓝莓中的花青素主要使用盐酸酸化的醇类，而花青素多用于食品，柠檬酸既是食品添加剂又是药物工业原料。鉴于鲜见到柠檬酸提取蓝莓花青素的相关报道，本试验以蓝莓为原料，研究柠檬酸浓度、料液比、提取温度、提取时间4个因素对蓝莓花青素中主要成分矢车菊素-3-O-葡萄糖苷（C3G）[9]含量的影响，运用正交试验法优化柠檬酸提取蓝莓花青素的工艺，旨在为开发蓝莓花青素功能性食品药品提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

蓝莓购自兰州市场，按1∶5比例加水打浆冷藏备用；纯水自制；柠檬酸（上海化学试剂厂），批号830905；矢车菊素-3-O-葡萄糖苷（C3G）（ChromaDex公司），纯度96.4%，批号528-58-5。

XS225A型电子分析天平普利塞斯，瑞士；优普UPT-I-20L落地式纯水机四川优普超纯科技；UV2300Ⅱ型双光束紫外可见光光度计（上海天美科学仪器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 蓝莓花青素的提取工艺 准确称取打浆蓝莓5.000 g，加入一定体积的柠檬酸溶液，在一定温度下加热，振荡，抽滤、定容[10]。

1.2.2 花青素含量的测定 通过紫外分光光度计测定，以C3G作为对照品，采用标准曲线计算法计算，花青素含量以C3G计[11，12]。

花青素含量=（n×v×f）/M，其中，n为样品浓度， v为样品体积，f为稀释倍数，M为蓝莓浆质量。

1.2.3 单因素试验 固定柠檬酸浓度（质量分数）30%，蓝莓果浆与柠檬酸溶液料液比1∶10（g/mL）、温度30 ℃、提取60 min的情况下，改变另外的因素水平，柠檬酸浓度（g/mL）为10%、20%、30%、40%、50%；料液比（g/mL）为1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25；温度为30、40、50、60、70 ℃；提取时间为30、60、90、120、150 min；进行单因素试验，以C3G吸光度为指标，择优参数。

1.2.4 正交试验设计 采用SPSS 19.0软件，在单因素试验基础上，依据单因素试验结果设置水平，以柠檬酸浓度、料液比、提取温度、提取时间4个因素的3个水平设计正交试验L9（34）优化柠檬酸提取蓝莓花青素工艺。

1.2.6 蓝莓中花青素含量测定 标准品溶液配制：准确称取C3G标准品（纯度96.4%）0.005 06 g，置于5 mL容量瓶中，加入甲醇，制成含C3G 0.975 6 mg/mL的储备液溶液。

样品溶液配制：准确吸取按照“1.2.1”制备的样品溶液1 mL，置于10 mL容量瓶中，加入甲醇，待测。

1.2.7 数据处理方法 采用SPSS 19.0统计软件，分析试验数据，结果以平均值±标准误差表示，对各组结果采用Duncans法进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 花青素含量测定

2.1.1 检测波长的选择 取C3G标准品溶液，进行紫外全波长扫描。由图1可知，C3G在可见光区域520 nm处有最大吸收，可見光区域520 nm处为其特征吸收，所以本试验在520 nm波长处检测C3G的含量。

2.1.2 线性关系考察 分别取标准品溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8 mL，置于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇定容，进行紫外分光测定。以吸光度（y）对C3G的质量浓度（x）（mg/mL）进行线性回归。结果（图2）显示，C3G在0～0.08 mg范围内与吸光度相关性较好，回归方程为y=22.161x+0.006 4，R2=0.998 8。

2.2 单因素试验结果与分析

2.2.1 柠檬酸浓度对蓝莓花青素吸光度的影响 结果（图3）显示，其他条件不变时，蓝莓花青素的吸光度随柠檬酸浓度的增加而增加。当柠檬酸浓度达30%时，吸光度最大，与其他浓度相比，差异显著，这是因为花青素在酸性条件下呈稳定的红色。柠檬酸浓度较小时，pH较高，花青素不溶于溶液；当柠檬酸浓度过大，花青素吸光度有所降低，由于酸性较强引起花青素水解，导致含量下降[13，14]。考虑其稳定性，防止花青素水解。因此选择柠檬酸浓度20%～40%为正交试验因素水平。

2.2.2 料液比对蓝莓花青素吸光度的影响 由图4可知，蓝莓花青素吸光度随着料液比的提高呈增加趋势。当料液比>1∶5时，蓝莓花青素吸光度大幅提高，说明花青素向提取液扩散速率变快，充分溶解，溶解量增大。而料液比继续增加，花青素吸光度变化不大，料液比超过1∶10吸光度基本不变，说明花青素溶解速率达到平衡，因此料液比选择1∶10～1∶20为正交试验因素水平。endprint

2.2.3 提取温度对蓝莓花青素吸光度的影响 由图5可知，蓝莓花青素吸光度随着提取温度的增长呈上升趋势。温度升至40 ℃时，粗提液中蓝莓花青素吸光度最高。随着温度进一步升高，蓝莓花青素吸光度开始下降，超过50 ℃吸光度显著下降。产生这种现象的原因可能是温度低，花青素溶出不完全，导致含量较低，然而花青素是热敏性色素，在高温下不稳定，结构容易发生改变[15]，所以升高到一定温度，部分花青素发生分解，使得花青素吸光度降低。因此选择30～50 ℃为正交试验因素水平。

2.2.4 提取时间对蓝莓花青素含量的影响 由图6可知，随着提取时间的延长，蓝莓花青素吸光度呈上升趋势，在30～90 min内花青素增加较快，超过120 min花青素含量不再上升，说明120 min左右花青素提取达到平台期。随着提取时间的增加，花青素被分解，吸光度略有下降。因此，试验选择60～120 min为正交试验因素水平。

2.3 正交试验

根据单因素试验结果，选择4个影响因素的3个水平设计正交试验L9（34）优化柠檬酸提取蓝莓花青素工艺，考察指标为花青素含量，正交试验结果见表2，正交试验最优工艺为A2B2C3D1。

方差分析结果见表3。由表3可知，柠檬酸提取蓝莓花青素的影响因素中柠檬酸浓度的影响极显著，提取温度、料液比和提取时间次之，影响不显著。极差分析结果中得出的最佳工艺是A2B2C3D2，即柠檬酸浓度为30%，料液比为1∶15，提取温度为50 ℃，提取时间为90 min。

2.4 验证试验

由于极差分析最优工艺与正交试验结果最优工艺不一致，正交试验最优工艺为A2B2C3D1，而极差分得出的最佳工艺是A2B2C3D2，所以需进行验证试验。以上述两组最佳工艺条件进行验证试验。结果表明，极差分析最优工艺下提取液花青素含量为3.62 mg/g， RSD=1.08%（n=6），正交试验最优工艺下提取液花青素平均含量为3.57 mg/g，RSD=0.58%（n=6）。根据提取率选择极差分析的最优工艺A2B2C3D2。

3 小结

在单因素试验基础上，运用正交试验法优化了柠檬酸提取蓝莓花青素的工艺条件。在正交试验设计所选条件范围内，柠檬酸浓度对蓝莓花青素含量的影响最大，其次为提取温度，然后是提取时间，料液比影响最小。验证试验确定柠檬酸提取花青素的最佳工艺参数为柠檬酸浓度为30%，料液比为1∶15 g/mL，提取温度为50 ℃，提取时间为90 min。最优工艺下花青素含量为3.62 mg/g。

花青素作为一种天然水溶性食用色素，不仅色泽鲜艳、安全、无毒，而且还具有良好的营养和保健功效，在食品、化妆品、医药等方面已显示出巨大的应用潜力[16]。蓝莓作为花青素含量最丰富的资源之一，研究其提取分离和开发利用具有重要的意义。随着人们生活水平的提高。对天然产品的需求量越来越大。天然的花青素主要作为食品药品中间体，提取多采用盐酸酸化的醇类、冰乙酸等溶剂提取[15，17]。冰乙酸气味刺激性较大，对食品口感影响较大。柠檬酸作为食品添加剂无色无味，对后期花青素的应用影响较小，本试验采用柠檬酸作为新的提取溶剂，旨在为蓝莓花青素资源的开发和利用提供新方法。

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