番茄环纹斑点病毒侵染辣椒挥发物成分分析及对西花蓟马行为反应影响

郑雪　陈勇　郑立敏　郑宽瑜　赵立华　陈永对　张洁

摘要：本试验以辣椒为寄主植物，研究西花蓟马对番茄环纹斑点病毒侵染辣椒后的行为反应，比较分析病毒侵染前后辣椒挥发物的异同。研究发现，与模拟接毒辣椒相比，西花蓟马偏好选择机械接毒辣椒，但在产卵量上二者没有显著性差异。从模拟接毒和带毒辣椒植株挥发物中共收集26 种化合物，含量差异显著的物质有14种。结果表明，西花蓟马对机械接毒辣椒植株有一定的偏好，番茄环纹斑点病毒侵染能诱导辣椒植株挥发物种类和含量的变化。

关键词：番茄环纹斑点病毒；西花蓟马；辣椒；行为反应；挥发物

中图分类号：S433.89 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2018）11-0111-05

Abstract The effects of Tomato zonate spot virus （TZSV） infection on plant attractiveness for Frankliniella occidentalis and the volatile compounds of the treated plants （infected and non-infected by TZSV） were studies. The results showed that F. occidentalis was more likely to select TZSV-infected pepper plants， whereas there was no significant difference between TZSV infected and non-infected pepper plants in the fecundity of F. occidentalis. Twenty-six types of compounds were identified from the treated pepper plants， and 14 types had significant difference between the two kinds of treated plants. In conclusion，TZSV-infection could alter the varieties and content of host volatile compounds， resulting in attracting thrips vector.

Keywords Tomato zonate spot virus； Frankliniella occidentalis； Pepper； Behavioral responses； Volatile

番茄斑萎病毒属病毒（Tospoviruses）在全球广泛分布，为害除禾本科之外的几乎所有粮食作物、蔬菜及观赏植物，每年在全球造成数十亿美元的经济损失。2008年在云南番茄上分离得到番茄环纹斑点病毒（Tomato zonate spot virus， TZSV），其在形态学、细胞病理学及基因组结构方面具有布尼亚病毒科（Bunyaviridae）番茄斑萎病毒属（Tospovirus）病毒典型的特征，属于西瓜银色斑驳病毒（Watermelan silver mottle virus， WSMoV）血清组成员[1]。近几年，TZSV在云南多个地区暴发流行，对烟草、番茄、辣椒等经济作物的生产构成了严重威胁[2， 3]。前期研究表明，西花蓟马是TZSV的主要传播介体之一。西花蓟马是本世纪初侵入我国的生物，隶属于缨翅目（Thysanoptera），蓟马科（Thripidae），花蓟马属（Frankliniella）。在昆虫与植物协同进化过程中，植物次生代谢产生的挥发性物质在它们之间的化学通讯中起着决定性作用，诱导着昆虫产生寄主定向、逃避、取食和选择产卵场所、聚集等行为[4-6]。

机械损伤、昆虫取食、植物病毒侵染等因素均可导致寄主植物产生一系列的生理生化反应，最终致使代谢产物发生改变[7， 8]，这些变化可能会对媒介昆虫产生有利或不利的影响，从而构成了媒介昆虫-病毒互作的内在植物生理学基础。作为病毒传播介体的寄主植物，其体内病毒诱导作用的变化在植物病毒的传播及流行过程中起着至关重要的作用。植物病毒侵染会导致寄主植物挥发物成分、含量、植物激素、接毒、防御等相关酶活性发生改变，或对植物感知昆虫危害并启动相应的防御反应产生干扰，从而影响媒介昆虫对寄主植物的选择性及适合度[9， 10]。

研究寄主植物挥发性次生物质的组成成分、特性、对昆虫的作用机理以及昆虫对植物挥发物的行为反应，将有助于阐明昆虫对寄主植物的选择機制。目前，关于虫害诱导的植物挥发物对昆虫影响的研究较多，主要集中在挥发性信息化合物的鉴定及功能的分析。有研究表明虫害诱导植物产生的挥发物对天敌有引诱作用，并且对部分植食性昆虫有排斥作用[11-13]；但也有研究表明，植物挥发物亦是很多植食性害虫寻找寄主植物的指示信号[14， 15]。

目前，关于植物病毒侵染导致寄主植物挥发物的改变对媒介昆虫影响的报道较少。鉴于此，本试验就番茄环纹斑点病毒侵染寄主植物辣椒后释放的植物挥发物对媒介昆虫西花蓟马行为反应的影响进行研究，并对TZSV侵染后的寄主植物辣椒挥发物的成分进行鉴定分析，以期为进一步阐明植物病毒-寄主植物-媒介昆虫三者互作关系提供行为学证据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试昆虫：西花蓟马采自云南省昆明市晋宁蔬菜大棚，实验室鉴定后用四季豆继代培养。饲养条件：（25±1）℃、相对湿度为70%～80%、16 h光照。

毒源：感TZSV的寄主植物番茄于2012年采自云南省元谋县，经RT-PCR检测后于-80℃条件下保存。

供试寄主植物：3～4片真叶期辣椒苗（辣椒种子为遵辣一号，由遵义市农业科学院园艺所惠赠）于人工气候箱内[（25±1）℃ ，16 h光照]培育。模拟接毒处理：仅用蒸馏水涂抹至健康辣椒上。机械接毒处理：将毒源通过摩擦接种方法接毒至健康辣椒苗上，获得感染TZSV植株（PCR检测带毒后供试）。

1.2 番茄环纹斑点病毒对介体昆虫西花蓟马选择行为的影响试验

采用玻璃Y型嗅觉仪测定介体西花蓟马对感染TZSV辣椒叶片的选择行为。Y型嗅觉仪臂长20 cm，内径1 cm，两臂夹角60°，管柄长15 cm，管柄上离夹角10 cm处连有5 cm长的释放管。每管用硅胶管分别连接一味源瓶（250 mL带磨砂口的容量瓶，分别内置感染TZSV的辣椒叶片和健康叶片），进入味源瓶的空气经活性炭过滤后再进入蒸馏水加湿瓶，以净化和增加空气湿度，管柄处接入真空泵，调节抽气速率为100 mL/min。试验在遮光的室内进行，顶灯为1盏15 W的荧光灯，测试环境室温为（25 ± 2）℃，湿度70% ～ 75%。

行为测定方法：挑选50头健康活泼并经过饥饿处理4 h的西花蓟马成虫，接到Y型管基部，观察其5 min内的行为选择反应，当西花蓟马越过某一侧臂的1/3并做一定时间的徘徊停留，则视为选择，5 min内未进入任何侧臂，则记为无选择，被排除在统计分析外。试验重复3次，每次重复调换Y型管方向并用95%乙醇擦洗Y型管，烘干以消除味源残留。记录进入两臂内西花蓟马的数量。

1.3 番茄环纹斑点病毒对介体昆虫西花蓟马产卵行为的影响试验

取20头同期刚羽化的西花蓟马雌成虫，单头饲养于放有模拟接毒和机械接毒辣椒叶碟的培养皿中任其孤雌生殖产卵，将培养皿置于人工气候箱内[（25±1）℃，16 h光照）]。每天记录孵化出的西花蓟马若虫数量，至成虫死亡，显微镜观察叶碟中未孵化卵数。每2天更换一次放有模拟接毒和机械接毒辣椒叶碟。试验重复 5次。

1.4 寄主植物挥发物的提取和鉴定

分模拟接毒和机械接毒辣椒植株2个处理。试验在室温下进行。

各处理称取15 g完整新鲜的叶片、茎干样品，分别置于100 mL的采样瓶中，瓶口用封口膜密封，待用。采樣瓶不能被装满，需预留顶空萃取空间。安装萃取头到手动进样手柄。100 μm PDMS萃取头和65 μm PDMS/DVB萃取头均在250℃下老化30 min（首次使用前需要老化）。用固相微萃取装置刺穿封口膜，插入采样瓶中，固定手柄高度后，推出萃取头，在顶空萃取30 min。快速移出萃取头立即插入气相色谱仪进样口中，热解析5 min进样，进行GC-MS分析。GC-MS分析条件[16]为毛细管柱：极性柱DB-5MS，膜厚0.25 μm，长30 m，内径0.25 mm；气谱条件：程序升温，45℃保持3 min，每分钟升温5℃，至230℃，保留5 min；氦气流速为1 cm/s。每次进样1 μL。进样口温度230℃，连接线温度180℃。不分流进样。数据处理：采用标准谱库和标样对照的方法对挥发物组分进行定性，用挥发物的峰面积进行相对定量比较。采用质谱库检索寄主植物的挥发物成分进行结构鉴定。

2 结果与分析

2.1 番茄环纹斑点病毒对介体昆虫西花蓟马选择行为的影响

Y型嗅觉仪器测试表明，TZSV对蓟马的选择偏好性有较大影响（表1）。面对模拟接毒和机械接毒后寄主植物辣椒散发的不同气味源，约13.4头的西花蓟马选择模拟接毒的辣椒，所占比例为26.8%，选择机械接毒辣椒的西花蓟马数量高达32.2头，占比达64.4%，二者之间均达到显著性差异。结果表明感染TZSV植株（机械接毒）散发的气味源对西花蓟马有较强的吸引作用，有利于西花蓟马获毒，促进病毒传播。

2.2 番茄环纹斑点病毒对介体昆虫西花蓟马产卵行为的影响

由表2可以看出，模拟接毒与机械接毒的辣椒叶片对西花蓟马产卵量没有显著影响，分别为24.20头和24.76头。

2.3 番茄环纹斑点病毒侵染对寄主植物辣椒挥发物成分及含量的影响

由表3可以看出，模拟接毒和机械接毒两组处理共检测出26种挥发性物质，含量差异显著的物质有14种。其中，（z）-3-已烯醛、（e）-2-已烯醛仅在机械接毒辣椒中检测到，而（e）-β-罗勒烯仅在模拟接毒处理中检测到。

模拟接毒和机械接毒两处理挥发物含量最高的两种化合物均为β-水芹烯和（Z）-3-己烯-1-醇，该两种化合物总量均超过各自处理组的50%，挥发物含量排在第3 位的均为（+）-2-蒈烯。除此之外，其余单种化合物的含量均低于5%，但间伞花烃、α-水芹烯、2-乙基-呋喃、二甲基硫醚、α-蛇麻烯、1-戊烯-3-醇、正戊醇、（z）-1， 5-二烯-3-醇、异戊醛在模拟接毒和机械接毒两组处理中的含量存在显著性差异。

3 讨论与结论

植物挥发性次生物质主要是植物的次生代谢物，这些次生化合物中的大多数对植物正常生长发育并不是很重要，但在植物与昆虫和螨类等节肢动物相互关系中显得非常重要，是形成植物气味特征物质的主体。在昆虫与植物协同进化过程中，植物次生代谢产生的挥发性物质在他们之间的化学通讯中起着决定性作用，在昆虫寻找识别寄主植物、产卵等过程中具有重要的通讯引导作用，挥发性物质在每种寄主植物中的成分、含量不尽相同，但主要包括烃类、醇、醛、酮、酯、有机酸和萜烯类等几类化合物[17]。

昆虫对不同植物的取食或产卵选择是昆虫与植物长期协同进化过程中形成的重要生存策略，植食性昆虫可利用植物传达的信息通过嗅觉或者结合视觉共同识别寄主植物[18]。植物在遭受损伤或被昆虫、微生物侵染后，作为一种直接或间接的防御信号，其挥发物的组成会产生明显的变化，从而影响植食性昆虫的行为。有研究表明，寄主植物在感染Tospoviruses代表种番茄斑萎病毒（TSWV）后，可以大量吸引介体蓟马到感病植物上取食[19]。本研究发现，与模拟接毒的辣椒相比，64.4%的西花蓟马选择带毒植株，选择模拟接毒辣椒的西花蓟马仅占26.8%，表明TZSV机械接毒至辣椒植株对西花蓟马有明显的引诱作用，与Abe等[19]的研究结果相同。中国番茄黄化曲叶病毒（Tomato yellow leaf curl China virus， TYLCCNV）和烟草曲茎病毒（Tobacco curly shoot virus， TbCSV）的侵染会导致传毒介体B型、ZHJ1两种生物型的烟粉虱在烟草和棉花上的平均产卵量显著增多[20]，在本研究中，西花蓟马在模拟接毒的试验组中产卵量稍低于在机械接毒辣椒叶片上的产卵量，但二者之间没有显著性差异。造成这种差异的原因可能与寄主植物、不同种类病毒侵染后释放的挥发物和媒介昆虫不同有关。

本研究兩组处理共鉴定出26种挥发性物质，其中模拟接毒组检测到24种，机械接毒组检测到25种，两组处理挥发物均以β-水芹烯和（Z）-3-己烯-1-醇为主要成分，该两种化合物总量均超过各自处理组的50%。与模拟接毒处理相比，机械接毒处理组挥发物成分新增加了（z）-3-已烯醛和（e）-2-已烯醛两种成分，这与虫害诱导的植物挥发物具有很高的多样性和可变性的规律相似[15]，且间伞花烃、（+）-2-蒈烯、α-水芹烯、α-蛇麻烯等成分含量显著上升，2-乙基-呋喃、二甲基硫醚、1-戊烯-3-醇、正戊醇、（z）-3-己烯-1-醇、（z）-1， 5-二烯-3-醇和异戊醛的含量显著下降。有研究表明，大多数植物遭遇虫害后均会释放萜烯类化合物，通过顶空抽样分析发现，与健康野生型番茄植株相比，受害野生型植株诱导了大量的挥发物产生，主要是萜烯类，包括 α-蒎烯、β-蒎烯和2-蒈烯等[11]，与本研究结果类似。萜烯类是很重要的植食性昆虫诱导的植物抗性物质，机械接毒后的辣椒植株诱导新增加了（z）-3-已烯醛和（e）-2-已烯醛，（+）-2-蒈烯、α-水芹烯和α-蛇麻烯的相对含量则明显增加，这可能与辣椒植株受病毒侵染后启动了自身相应的防御反应有关。

植物病毒作为农田生态系统的关键因子之一，对寄主植物和植食性昆虫有重要的影响，其诱导寄主植物挥发物在引诱或驱避害虫中的关键作用需要深入探讨，对于诱导途径还需从分子水平上揭示其机理。

参 考 文 献：

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