肥胖抑制素减轻高糖致大鼠INS1细胞的凋亡

徐 敏，王 威，姜方旭，乔 虹，张 玲

(1.哈尔滨医科大学附属第二医院 内分泌与代谢病科， 黑龙江 哈尔滨 150086； 2.西澳大学Harry Perkins医学研究院， 尼德兰兹 WA6009； 3.郑州市第三人民医院 内分泌科,河南 郑州 450000)

研究论文

肥胖抑制素减轻高糖致大鼠INS1细胞的凋亡

徐 敏1,3，王 威1*，姜方旭2，乔 虹1，张 玲1

(1.哈尔滨医科大学附属第二医院 内分泌与代谢病科， 黑龙江 哈尔滨 150086； 2.西澳大学Harry Perkins医学研究院， 尼德兰兹 WA6009； 3.郑州市第三人民医院 内分泌科,河南 郑州 450000)

目的探讨肥胖抑制素(OB)减轻高糖致大鼠胰岛细胞系INS1细胞的凋亡作用。方法INS1细胞在不同糖浓度环境下培养24 h，用MTT法检测INS1细胞存活率和增殖；Hoechst33258细胞核染色法检测细胞核形态学；酶标法检测caspase- 3活性及OB的保护作用是否涉及了PI3K；real-time PCR检测FOXO1、SREBP1c、Bax和PDX- 1 mRNA的表达。结果在高糖条件下，OB促进INS1细胞的增殖，在100 nmol/L浓度时能最大程度促进INS1细胞增殖(与对照组、高糖组相比，P<0.01)。OB能减轻高糖诱导的凋亡(P<0.01)；在高糖组，FOXO1、SREBP1c和Bax基因表达较对照组增多，PDX- 1表达减少；反之在OB干预的高糖组；FOXO1、SREBP1c和Bax表达减少，PDX- 1表达增多。结论OB能够减轻高糖致大鼠INS1细胞的损伤作用。

肥胖抑制素；糖毒性；INS1细胞；保护作用

2型糖尿病(type 2 mellitus diabetes，T2DM)在全世界发病率不断增加，成为一个威胁健康的主要问题[1]。持续的高血糖症能够引起氧化应激、ER应激和缺氧应激等，从而导致胰岛β细胞数量及功能下降，最终形成2型糖尿病[2]。肥胖抑制素(obestatin,OB)是2005年在生物信息学搜索的基础上发现，它是由23个氨基酸组成，C末端甘氨酸残基带有酰基化修饰基因，并且由prepro-ghrelin编码(ghrelin前体)[3]。Obestatin这一术语起源于拉丁语“obedere”,意为“吞食”,OB意为肥胖抑制素。OB的生理作用最初被认为与胃饥饿素(ghrelin)相反，能够抑制食欲或者促进生长激素(GH)的分泌[3]。OB能通过影响糖、脂代谢阻止糖尿病的发生[4]。但是OB的受体仍存在争议。有研究显示，人的胰岛细胞及β细胞系在炎性反应因子作用条件下，OB能够使PI3K/Akt、ERK1/2及cAMP磷酸化，并能够促进胰岛素分泌及相关基因表达，从而对胰岛β细胞发挥保护作用[5]。在2型糖尿病患者的胰岛中发现FOXO1的mRNA水平是增加的[6]。FOXO1是PI3K/Akt信号路径的下游因子。那么，OB在糖毒性条件下，能否对胰岛β细胞发挥保护作用？这点仍然不清楚。本研究，证实了在糖毒性条件下，OB对β细胞的保护作用涉及了PI3K信号通路、FOXO1因子、ER应激、线粒体功能及胰岛素信号相关通路。

1 材料与方法

1.1 材料

大鼠INS1胰岛细胞系(美国康奈尔大学)；RPMI-1640培养基和胎牛血清和0.25%含EDTA胰蛋白酶(Gibco公司)；青链霉素(碧云天公司)；D-glucose、噻唑蓝(MTT)(Sigma公司)；OB(Phenix公司)；细胞凋亡荧光Hoechst33258试剂盒(北京索莱宝公司)；Trizol、RT-PCR引物(Invitrogen公司)；反转录试剂盒和荧光定量试剂盒(Roche公司)；

1.2 方法

1.2.1 细胞的培养与分组：将INS1细胞在37 ℃水浴箱中快速复苏，培养基重悬将细胞混悬液立即放入已经准备好的装有10% FBS RPMI- 1640培养液的离心管中，离心5 min，取出倒掉上清，加入10% FBS RPMI- 1640培养液4 mL，把细胞吹打混匀，移入25 cm2的培养瓶中，放入5% CO2培养箱中37 ℃培养，待增殖至瓶壁75%时即可传代。

1.2.2 MTT法测定细胞增殖测定：将INS1细胞分为对照组(11.1 mmol/L)和高糖组(55.5 mmol/L)在1640培养基中，加或不加OB(浓度为1、10、100和500 nmol/L)接种于96孔板，培养24 h，每孔加入20 μL MTT(5 g/L)后放入5% CO237 ℃细胞培养箱中进行孵育，4 h后终止孵育，小心弃去上清，注意尽量避免吸取紫色结晶(formazan,甲瓒)，加入DMSO 150 μL/孔，放入空气摇床中，摇晃10 min，使DMSO与甲瓒充分融合。然后将96孔板放入酶联免疫检测仪中，波长调至570 nm，开始检测每个孔的A值。

1.2.3 Hoechst33258细胞核染色：使用6孔板，在孔板中放入已经高压、灭菌的盖玻片，放入细胞对照组和高糖组的悬液，待细胞爬片。之后弃去上清，分为对照组及高糖组放入5% CO2、37 ℃细胞培养箱中进行培养。在显微镜下观察，INS- 1细胞增殖至覆盖底部面积的约50%～80%，吸去上清，加入固定液0.5 mL，固定10 min。之后吸去固定液，使用PBS洗2遍，每次3 min，尽量吸净液体。在载玻片上滴上1滴抗荧光衰减剂，小心盖上有细胞的盖玻片，让细胞小心接触封片液，避免产生气泡。使用荧光显微镜观察，调整最大激发波长为352 nm，最大发射波长为461 nm。对照组细胞核为蓝色椭圆形，高糖组细胞核出现核固缩和核碎裂现象。

1.2.4 酶标法caspase- 3活性检测：参照caspase- 3细胞活性检测试剂盒进行检测。在对照组及高糖组加或不加obestatin(100 nmol/L)以及PI3K阻断剂LY294002(LY)干预24 h，后开始收集细胞，按照每200万个细胞加入细胞裂解液的比例进行细胞裂解，冰浴裂解15 min，4 ℃ 16 000～20 000×g离心15 min，把上清移入预冷的离心管，立即测定caspase- 3细胞活性。

1.2.5 Real-time PCR测定FOXO1、Bax、SREBP1c、PDX1 mRNA的表达情况：分组干预后收集细胞离心，按照Trizol试剂说明书提取RNA，测取浓度并反转录成cDNA，应用SYBR Green荧光染料法进行real-time PCR测定。各引物序列：β-action：5′-CCTG TGGCATCCATGAAACTAC-3′(上游)，5′-CCAGGG CAGTAATCTCCTTCTG-3′ (下游)；FOXO1：5′-ACA CCATGCCTCACACATCTG-3′ (上游)，5′-GGAGGAC ACCCATCCTACCA-3′(下游)；Bax:5′-AGCGAGT GTCTCAGGCGAAT-3′ (上游) 5′-CCGGCCCCAGTT GAAGTT-3′(下游)；SREBP1c：5′-GCCCAGGTGACC CGACTATT-3′ (上游)，5′-GACAGCGTCAGAACAG CTATTTAGC-3′ (下游)；PDX1：5′-GAGCTGGCAGT GATGATGCTCAA-3′ (上游)，5′-ACAATCCTGCTC CGGCTCTT-3′ (下游)。基因表达量使用2-△△Ct相对定量法计算。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 在高糖毒性条件下， OB能促进细胞INS1的增殖

高糖组的增殖率低于对照组(P<0.01)。在对照组和高糖组，OB在100 nmol/L时能够达到最大增值率，与对照组相比增值率达137%(P<0.01)，与高糖组相比增值率达37%(P<0.01)。无论是在对照组还是高糖组OB浓度至少在10 nmol/L时才能促进β细胞增殖(图1)。

*P<0.05，**P<0.01 compared with control；#P<0.05，##P<0.01 compared with high glucose图1 在高糖条件下，OB促进INS1细胞的增殖Fig 1 OB promotes INS1 cells proliferation under glucotoxicity state(±s, n=5)

2.2 在糖浓度为55.5mmol/L条件下， INS1细胞核出现固缩和碎裂

在对照组可见到细胞核呈蓝色椭圆形，高糖组中可见到细胞核出现固缩、碎裂(图2)。

图2 高糖浓度对INS1细胞核的影响Fig 2 Effect of glucose with higher concentrations on INS1 nucleus morphology were detected by Hoechst33258(original magnification ×400)

2.3 OB保护β细胞拮抗高糖诱导凋亡，涉及了PI3K信号通路

胰岛β细胞在对照组和高糖组加或不加PI3K阻断剂LY294002(LY)和OB，OB的浓度为100 nmol/L，LY的浓度为50 μmol/L。对照组+ LY组caspase- 3活性和对照组相比显著增高(P<0.05)，对照组+OB组caspase- 3活性和对照组相比显著降低达36%(P<0.01)，对照组+OB+LY组caspase- 3活性和对照组+OB组相比显著升高达31%(P<0.05)，对照组+OB+LY组caspase- 3活性和对照组+LY组相比降低达32%(P<0.01)。高糖组caspase- 3活性明显升高与对照组相比(P<0.01)，高糖组+OB组caspase- 3活性和高糖组相比显著降低达43%(P<0.01)。高糖组+OB+LY组caspase- 3活性和高糖组+OB组相比显著升高达57%(P<0.05)，高糖组+OB+ LY组caspase- 3活性和高糖组+LY组相比显著降低达36%(P<0.01)(图3)。

2.4 OB涉及了 FOXO1、线粒体、内质网及胰岛素相关通路

1)高糖组与对照组比较FOXO1基因表达明显增多(P<0.05)；对照组+OB组与对照组比较FOXO1基因表达明显减少(P<0.01)；高糖组+OB组与高糖组比较，FOXO1基因表达明显减少(P<0.01)。2)高糖组与对照组比较Bax基因表达明显增多(P<0.01)；对照组+OB组与对照组比较Bax基因表达明显减少(P<0.01)；高糖组+OB组与高糖组比较，Bax基因表达明显减少(P<0.05)。3)高糖组与对照组比较SREBP1c基因表达明显增多(P<0.01)；高糖组+OB组与高糖组比较，SREBP1c基因表达明显减少(P<0.05)。4)对照组与高糖组比较PDX1基因表达明显减少，具有统计学差异(P<0.01)；对照组与对照组+OB组比较PDX1基因表达增多(P<0.05)；高糖组与高糖组+OB组比较，PDX1基因表达明显减少(P<0.05)； 糖浓度为高糖组+OB组与高糖组比较， PDX1基因表达明显减少(P<0.01)(图4)。

*P<0.05，**P<0.01；#P<0.05，##P<0.01 图3 在高糖条件下，OB能够影响INS1细胞caspase- 3活性并且这与PI3K通路相关Fig 3 Under high glucose state,the effect of OB on caspase- 3 activity of INS1 pancreatic β-cells and its association with PI3K path way

3 讨论

OB是最近新发现的一种激素，是由ghrelin前体(prepro-ghrelin)基因编码，能够促进β细胞和人的胰岛细胞存活，促进胰岛素分泌，但是其具体的分子机制仍然不是很明确[5]。OB是否保护2型糖尿病患者中处于高糖环境的胰岛β细胞仍有待确定。在本研究中发现，在高糖条件下OB能促进β细胞的增殖；OB能抑制高糖条件下诱导的凋亡，这与PI3K通路相关；其保护作用涉及ER应激、线粒体、胰岛素信号通路以及FOXO1因子。

高糖能够刺激胰岛β细胞氧化应激、ER应激、缺氧应激以及诱导炎性反应因子水平增加，使胰岛β细胞发生凋亡、自噬、去分化以及增值降低，最终引起β细胞数量及功能障碍[6- 8]，最终形成2型糖尿病。有研究显示OB在炎性反应介质环境下，能够磷酸化PI3K、ERK1/2、CAMP和IRS2信号路径，从而保护大鼠胰岛β细胞以及人的胰岛细胞[5]。但是目前还没有研究证明，在高糖条件下OB对胰岛β细胞发挥保护作用机制。PI3K通路与胰岛细胞增殖和胰岛素分泌关系非常密切， FOXO1是PI3K信号路径的下游因子[9- 11]。 有研究证明， 在一项关于人的研究中证明了在2型糖尿病患者的胰岛中发现FOXO1的mRNA水平是增加的[12]。此次研究，证明了在高糖条件下，OB能够促进胰岛细胞增殖；OB能抑制高糖诱导的凋亡，这与PI3K通路相关；OB对胰岛β细胞的保护作用涉及了FOXO1因子、ER应激、线粒体及胰岛素相关通路。

A.FOXO1 gene expression; B.Bax gene expression; C.SREBP1c gene expression; D.PDX- 1 gene expression;*P<0.05，**P<0.01 compared with control；#P<0.05，##P<0.01 compared with high glucose

本次实验证明了在高糖条件下能够最大抑制胰岛β细胞的活性达24%，在形态学证实了高糖能够使细胞核发生变化，核固缩和核碎裂(图3)。有报道证实，OB在100 nmol/L时能够对胰岛细胞产生最大的促增殖作用[5]。这次研究也证实了这个结论，OB浓度为100 nmol/L时能够对胰岛细胞产生最大的促增殖作用，OB起保护作用的浓度至少是10 nmol/L。OB在500 nmol/L的浓度增值率与浓度100 nmol/L OB相比稍下降，可能与受体饱和有关。

caspase- 3是凋亡的标志物，为了进一步探讨OB在高糖条件下能否拮抗INS1细胞的凋亡，在对照组和高糖组分别加入浓度为100 nmol/L的OB，发现加入OB后caspase- 3活性明显下降，认为OB能够拮抗高糖诱导的细胞凋亡。为了进一步证实OB能够拮抗高糖诱导的细胞凋亡是否与PI3K通路相关，加入了PI3K通路阻断剂LY294002，通过caspase- 3的变化证实了OB保护β细胞拮抗高糖诱导的凋亡，这与PI3K信号通路相关。这次实验也证明了OB不能够完全拮抗高糖引起的凋亡，暗示了存在其他通路参与了这个过程。

高血糖能够诱导氧化应激、ER应激、缺氧应激以及诱导炎性反应因子的水平增加[13]。为了进一步探索OB对胰岛β细胞的保护作用是否涉及了FOXO1因子、ER应激、线粒体及胰岛素相关通路。在高糖组FOXO1 mRNA表达的量与对照组相比明显增加，这点与在一项关于人的研究中证明了在2型糖尿病患者的胰岛中发现FOXO1的mRNA水平是增加的[14]相一致。促凋亡基因BCL2家族成员基因Bax基因，这个基因与线粒体相关，在高糖组也出现类似的结果，加入OB后FOXO1和Bax表达明显下降，认为OB拮抗高糖组保护β细胞涉及了FOXO1因子和线粒体通路。SREBP1c是转录因子固醇调节原件结合蛋白- 1C，是一个转录因子，是在内质网膜合成，CHOP- 10是促凋亡CCAAT/增强结合蛋白(C/EBP),也被称作GADD153，它是C/EBP家族的转录因子[15]，这两者都是公认的ER应激标志物。在高糖条件下，内质网应激标志物CHOP- 10和SREBP1c与对照组相比表达增多，加入OB后CHOP- 10、SREBP1c表达明显降低，认为OB拮抗高糖保护β细胞涉及了内质网相关路径。在高糖条件下OB保护β细胞与CHOP- 10下调有关。PDX- 1是一个控制β细胞增殖和胰岛素分泌功能的关键转录因子，具有促进胰岛素的合成和分泌作用，INS1是胰岛素相关基因。本次实验结果也表现出在高糖组PDX- 1和INS1表达是降低的，加入OB后PDX- 1和INS1表达是增高的，由此推测OB对胰岛细胞的保护作用涉及了胰岛素信号通路。

总之，在高糖条件下，OB对胰岛细胞的保护作用涉及FOXO1因子、ER应激、线粒体路径和岛素信号通路。虽然目前对于OB作用的受体不明确，但是OB对于胰岛β细胞的保护作用将会成为对于糖尿病治疗的一个新策略。

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Obestatin attenuates apoptosis induced by high glucose in INS1 cells

XU Min1,3, WANG Wei1*, JIANG Fang-xu2, QIAO Hong1, ZHANG Ling1

(1.Dept. of Endocrinology and Metabolism， the Second Affiliated Hospital of Harbin Medical University，Harbin 150086,China;2.Harry Perkins Institute of Medical Research, University of Western Australia, Nedlands WA 6009, Australia;3.Dept. of Endocriology, the Third People’s Hospital of Zhengzhou, Zhengzhou 450000, China)

ObjectiveTo investigate the effect of obestatin on the apoptosis of rat pancreatic islet cell line INS1 induced by high glucose.MethodsINS1 cells were cultured in different concentrations of glucose.The survival rate and proliferation of INS1 cells were detected by MTT method;Hoechst33258 nuclear staining was used to detect nuclear morphology. caspase- 3 method was used to study the relationship between the protective effect of obestatin and the PI3K pathway; Finally，using real-time PCR detection ofFOXO1 andSREBP1c,Bax,PDX- 1 expression, to further clarify the protective effect of obestatin on cells.ResultsIn high glucose condition,obestatin promoted the proliferation of INS1 cells at 100 nmol/L,and promoted the proliferation of INS1 cells significantly(P<0.01, compared with the control group and high glucose group).Obestatin can reduce high glucose-induced apoptosis(P<0.01).The expressions ofFOXO1,SREBP1c,BaxandPDX- 1 decreased,while the expression ofFOXO1,SREBP1c,BaxandPDX- 1 increased in high glucose group.ConclusionsOB can attenuate the injury of INS1 cells induced by high glucose in rats.

obestatin; glucotoxicity;INS1 cells; protection

2016- 06- 16

2017- 02- 09

国家自然科学基金(81471081);黑龙江省自然科学基金(H201416);黑龙江省教育厅科学技术研究项目(11551199);哈尔滨医科大学附属第二医院博士基金(BS2011- 12)

*通信作者(correspondingauthor)：wwei19742007@hotmail.com

1001-6325(2018)01-0007-06

IQ291

A