水稻白叶枯病植株内生细菌的分离及其拮抗功能

杨俊誉　陈小龙　高玲玲　黄琼

摘要：从云南省感染水稻白叶枯病的病株和健康植株上共分离得到475株植株内生细菌，从中筛选出167株对水稻白叶枯病病菌（Xanthomonas oryzae pv oryzae，简称Xoo）有拮抗作用的内生细菌。病株体内拮抗内生细菌的菌株数量多于健康植株，病株和健康植株根、茎、叶中的内生细菌菌株数量略有不同，从病株根、茎、叶中分离出的拮抗内生细菌对水稻白叶枯病病菌的抑制作用差异不显著；而从健康植株的茎部和叶部分离出的拮抗菌对水稻白叶枯病病菌的抑制作用显著高于根部拮抗菌（P<005）。采用对峙培养方法测定并比较分离菌株的抑菌能力，得到30株对白叶枯病菌抑菌能力较强的菌株，并对其进行5种病菌的抑菌谱测定。结果显示，30株菌株对5种水稻病害的病原菌均有抑制作用。通过16S rDNA序列分析发现，水稻内生拮抗细菌分别与GenBank序列数据库中17个属的细菌相似性较高，其中，农杆菌属（Agrobacterium）、短状杆菌属（Brachybacterium）、克雷伯菌屬（Klebsiella）、鞘氨醇杆菌属（Sphingobacterium）和葡萄球菌属（Staphylococcus）为发病植株特有的拮抗细菌属，而节杆菌属（Arthrobacter）和考克斯菌属（Kocuria）仅存在于对照植株中。

关键词：水稻白叶枯病病菌；内生细菌；拮抗细菌；抑菌谱；16S rDNA；种群结构

中图分类号： S4351114+7文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2017）21-0100-06

收稿日期：2016-05-25

基金项目：公益性行业（农业）科研专项（编号：201303015）。

作者简介：杨俊誉（1990—），男，云南楚雄人，硕士研究生，主要从事植物细菌病害研究，E-mail：yangjunyu900708@163com；陈小龙（1982—），男，河南安阳人，博士，主要从事植物病理学研究，E-mail：cxlong119@163com。

通信作者：黄琼，博士，教授，主要从事植物病理学研究。E-mail：huangqiong88hs@163com。

水稻是我国主要的粮食作物，由水稻白叶枯病病菌（Xanthomonas oryzae pv oryzae，简称Xoo）引起的水稻白叶枯病是水稻生产上一种重要的细菌性病害1-2]。自1884年水稻白叶枯病首次在日本九州岛福冈地区被发现，至今已有120多年的历史，尽管一些化学农药已在生产上用于防治该病，但效果并不十分理想。

Bayot等对植物内生细菌的种类、定殖部位以及与植物的生理与病理的相关关系进行了大量的研究3]。Kennedy等报道，大多数植物内生细菌具有一定的运动性，这不仅有利于内生细菌吸收营养物质，还有利于其避开外界环境的压力以保护自己4]。同时大多数内生细菌定殖于植物薄壁组织的细胞间隙，有些定殖于细胞质中，有些可穿过细胞壁进入细胞内，有些则定殖于微管束组织中，但数量较少，可能是因为维管束中出现大量的细菌会导致维管束阻塞，使植物致病5-6]。研究发现，不同寄主植物品种中内生细菌的种群不同，即使是同一种植物的不同品种之间，其内生细菌的种类、数量和分布均有一定甚至较大的差异7-9]。

利用内生细菌防治水稻白叶枯病已有较多的研究，但是关于白叶枯病的发生对水稻内生细菌的分布和拮抗作用的影响鲜见报道。本研究分析白叶枯病的发生对水稻拮抗内生细菌的种类以及分布特性的影响，旨在为水稻白叶枯病的防治及水稻拮抗内生细菌的开发与利用奠定基础。

1材料与方法

11试验材料

111供试内生细菌

样品采集于云南省红河州植物保护站试验田（23°24′N，103°21′E）。水稻品种为宜香2239，对水稻白叶枯病表现为中抗。在水稻孕穗期自然发病的田块进行采样，病株和健康植株（对照）来自于同一试验田的同一品种。试验田中共有2个发病位置，在发病区域内呈“S”形取样，采集病株共计30丛；并于发病植株与健康植株的交界处周围10 m的位置采集健康植株共计30丛，采集的样品生长状态一致。

112供试植物病原细菌和真菌

2种病原细菌分别为水稻白叶枯病病菌、水稻细菌性条斑病病菌（Xanthomonas oryzae pv oryzicola），3种病原真菌分别为水稻稻瘟病病菌（Pyricularia oryzae Cav）、纹枯病病菌（Rhizoctonia solani Kühn）、恶苗病病菌（Fusariun moniliforme Sheld），上述5种病原菌均由笔者所在实验室提供。

12试验方法

121水稻内生细菌的分离

样品用自来水冲洗干净，用滤纸吸干水分后分别称取1 g根、茎、叶进行表面灭菌10]。其中发病植株根、茎、叶内生细菌的分离选择病健交界处，而对照植株选取3个大小、位置均与发病植株一致的部位进行分离。将经表面消毒的材料置于已灭菌的研钵中碾磨至糊浆状，加入9 mL灭菌水，静置15 min，再取200 μL上清液涂布于NA培养基中，于28 ℃培养箱中培养8 d。参考《伯杰氏细菌鉴定手册》中的平板菌落计数法进行细菌数量的统计，采用《伯杰氏细菌鉴定手册》中的细菌常规鉴定法进行细菌的分类鉴定11]，确定具有相同菌落形态的细菌归为一类。同时挑选菌落形态、色泽等特征有差异的单菌落，于NA培养基上划线纯化，最终将纯化的细菌菌落移入含NA培养基的试管中，并保存于4 ℃冰箱中备用。

122拮抗内生细菌的筛选

1221对水稻白叶枯病病菌和水稻细菌性条斑病病菌的拮抗作用

取200 μL病原细菌悬浮液于NA平板上，均匀涂布后吹干，平板中心放置直径为5 mm的圆形灭菌滤纸片，取5 μL分离保存的内生细菌经活化后的菌液接种在滤纸片上，置于28 ℃恒温箱中培养72 h后观察和测量抑菌圈的直径。每个处理3次重复。endprint

1222对水稻稻瘟病病菌、纹枯病病菌、恶苗病病菌的抑制作用

使用PDA培养基活化各病原真菌12]，用直径为 6 mm 的打孔器打出病原真菌的菌饼，用接种针将菌饼放置在新鲜的PDA培养平板中心，然后在距离菌饼2 cm处用灭菌牙签采用3点接种法接种拮抗菌株，3个重复，并以不接种拮抗菌株作为对照，于25 ℃恒温箱中培养。当对照中的菌落长满整个培养皿时，测量具有抑菌现象菌株的抑菌圈直径。

123拮抗内生细菌的分子鉴定

1231拮抗内生细菌的PCR鉴定

基因组DNA的制备选用十六烷基三甲基溴化铵法（CTAB法）13]。利用细菌 16S rDNA 通用引物27f（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1 492r（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）对具有拮抗作用的内生细菌进行16S rDNA PCR扩增14-15]。引物合成和测序工作均由深圳华大基因科技有限公司完成。

1232拮抗内生细菌的鉴定及16S rDNA序列分析

采用细菌常规鉴定法对具有拮抗作用的细菌菌株进行形态学分类11]，选取具有不同菌落形态和拮抗功能的代表菌株进行16S rDNA序列测定。利用Blast程序在GenBank序列数据库中获取同源性最高的菌株登录号（http：wwwncbinlmnihgovblastBlastcgi），定义16S rDNA序列同源性大于97%的菌株为同一个种16]。并向NCBI数据库提交上述菌株序列，获得其基因登录号。同时对根、茎、叶中分离的所有内生拮抗菌株数量进行统计，确定感染白叶枯病病菌的水稻植株与健康水稻植株中内生拮抗细菌种群菌株数量的比例分布，并用该比例定义为细菌种群的结构分布，为拮抗内生细菌的筛选奠定基础。

13数据统计方法

采用Excel 2007对数据进行处理和绘图，运用SPSS 200统计分析软件对数据进行t检验和方差分析，显著性水平设定为P<005。

2结果与分析

21水稻内生细菌的分离

通过对健康植株根、茎、叶进行水稻白叶枯病病菌的分离，10-1～10-8 CFUg悬浮液在NA平板上均没有分离到水稻白叶枯病病菌，表明对照植株为不带白叶枯病病菌的样品。

本研究从水稻白叶枯病株和健康植株植物组织中共获得475株内生细菌，所有分离得到的内生细菌单个菌株种群数量平均值为69×105 CFUg。其中，从病株中共分离出229株内生细菌，根部99株，茎部58株，叶部72株；JP3]从健康植株中共分离出246株内生细菌，根部106株，茎部62株，叶部78株。

22拮抗内生细菌的筛选

由表1可知，从475株内生细菌中共筛选出167株对水稻白叶枯病病菌有拮抗作用的内生细菌菌株，其中在病株上获得93株，在对照植株上获得74株，在发病植株内分离得到的拮抗内生细菌的菌株数量多于对照植株。从水稻植株不同部位分离得到的内生细菌菌株数量存在明显的差异，病株中不同部位分离得到的菌株株数表现为叶>根>茎，而对照植株中不同部位分离得到的菌株株数表现为根>葉>茎。经白叶枯病病菌对峙培养试验测定抑菌效果，组3、组4的抑菌效果较好，组1的抑菌效果最差。拮抗内生细菌对水稻白叶枯病病菌的抑菌直径在30～80 mm之间的组2，其拮抗细菌的菌株数量在发病植株和对照植株中差异较大。

由表2可知，比较发病植株和对照植株的内生细菌对水稻白叶枯病菌的抑菌圈直径得出，在组1（F=0421，P>005）、组2（F=1179，P>005）和组3（F=0757，P>005）中差异不显著；而组4中发病植株内生细菌的抑菌圈直径显著大于对照植株（F=5922，P<005），其中发病植株和对照植株茎（F=0022，P>005）、叶（F=1774，P>005）中的内生细菌对水稻白叶枯病病菌的抑菌圈直径差异不显著，发病植株根（F=21778，P<005）中的内生细菌对水稻白叶枯病病菌的抑菌圈直径显著大于对照植株。拮抗内生细菌对水稻白叶枯病病菌的影响主要表现在抑菌能力较强的细菌上，且这种影响主要体现在根部。

发病植株和对照植株的拮抗内生细菌的抑菌圈直径差异不显著（F=0148，P>005），其中两者的根与根（F=2077，P>005）、茎与茎（F=0233，P>005）之间的内生细菌对水稻白叶枯病病菌的抑菌圈直径差异也不显著，但发病植株和对照植株的叶与叶（F=8054，P<005）之间的内生细菌对水稻白叶枯病病菌的抑菌圈直径存在显著性差异，病株叶部拮抗细菌的抑菌圈直径显著高于对照植株。同时，病株的根与茎（F=1040，P>005）、根与叶（F=0270，P>005）、茎与叶（F=2760，P>005）以及对照植株的茎与叶（F=1437，P>005）之间的抑菌圈直径大小差异均不显著，但对照植株茎部（F=4604，P<005）和叶部（F=14681，P<005）的内生细菌抑菌圈直径均显著高于根部。研究表明，水稻白叶枯病害的发生提高了水稻根、茎、叶内生细菌的抑菌能力，并且这种改变在水稻的根部最为明显。

为了测定对水稻白叶枯病病菌抑菌效果较好的拮抗细菌的抑菌谱，采用对峙培养法测定组4中30株菌株对水稻白叶枯病病菌、水稻细菌性条斑病病菌、稻瘟病病菌、水稻纹枯病病菌、水稻恶苗病病菌的拮抗能力。由表3可知，这30株菌株对5种水稻病害的病原菌均有一定的抑制作用，其中对水稻细菌性条斑病病菌的抑菌圈直径为46～339 mm，对水稻稻瘟病病菌的抑菌圈直径为69～239 mm，对水稻纹枯病病菌的抑菌圈直径为46～135 mm，对水稻恶苗病病菌的抑菌圈直径为41～145 mm。方差分析结果表明，对照植株的内

生细菌对水稻细菌性条斑病病菌（F=9376，P<005）和水稻纹枯病病菌（F=17761，P<005）的抑菌圈直径均显著大于发病植株的内生细菌，而对水稻稻瘟病病菌（F=1256，P>005）和水稻恶苗病病菌（F=0127，P>005）的抑菌圈直径与发病植株的内生细菌差异不显著。endprint

23拮抗内生细菌的鉴定及16S rDNA基因序列分析

将具有拮抗作用的167株内生细菌依据形态学分为48类内生细菌，选取其中48株代表菌株进行16S rDNA 通用引物27f、1 492 r的PCR扩增，PCR产物由深圳华大基因科技有限公司进行测序。通过16S rDNA序列分析表明，水稻内生细菌分别与GenBank数据库中17个属的细菌相似性较高（表4）。因此，167株内生细菌分别属于17个细菌属。确定感染白叶枯病病菌的水稻植株与健康水稻植株中内生拮抗细菌属群菌株数量的比例分布，统计水稻拮抗内生细菌的种群结构。由图1可知，发病植株的内生拮抗细菌共包含14个属，健康植株包含11个属，其中不动杆菌属（Acinetobacter）、芽孢杆菌属（Bacillus）、微小杆菌属（Exiguobacterium）、赖氨酸芽孢杆菌属（Lysinibacillus）、微杆菌属（Microbacterium）、类芽孢杆菌属（Paenibacillus）、假单胞菌属（Pseudomonas）、根瘤菌属（Rhizobium）、寡养单胞菌属（Stenotrophomonas）共9个属为发病植株和健康植株所共有，农杆菌属（Agrobacterium）、短状杆菌属（Brachybacterium）、克雷伯菌属（Klebsiella）、鞘氨醇杆菌属（Sphingobacterium）和葡萄球菌属（Staphylococcus）为发病植株特有的拮抗细菌属，而节杆菌属（Arthrobacter）和考克斯菌属（Kocuria）仅存在于健康植株中。发病植株和健康植株内生拮抗细菌的优势菌属均为芽孢杆菌属，且健康植株中芽孢杆菌属的拮抗细菌所占比例较高。

3结论与讨论

本研究结果表明，水稻健康植株和发病植株的根、茎、叶中均有大量的内生细菌， 其种群数量平均值为 69×105 CFUg，

这与黎起秦等报道的水稻、小麦内生细菌的种群数量17-18]相似，而与Seghers等报道的玉米、甘蔗根部、高梁内生细菌种群数量19-20]存在差异。说明植物内生细菌的种群密度与植物的物种、基因型、植物组织、生长阶段和环境条件等有关21]。水稻不同部位内生细菌的菌株数量存在差异，水稻根部细菌的菌株数量最高，其次是茎、叶。可能是因为水稻的根从土壤中吸收了大量的营养为内生细菌的生长提供了丰富的养分22]。多数植物内生细菌不仅存在于植株体内，也常见于土壤，而水稻内生细菌大多来源于根际土壤，由土壤首先进入植株根中，并在根内定殖，然后在植株体内转移。

水稻白叶枯病发生以后，尽管内生细菌的总量没有发生改变，但拮抗菌的数量发生了明显的变化。病株中拮抗菌的菌株数量明显增多，主要表现在叶部拮抗菌菌株数量的增多，且抑菌圈直径与对照植株存在显著性差异（P<005）。同时，病株和对照植株中拮抗菌的抑菌能力在组4中存在显著性差异（P<005），并且这种差异主要体现在根部。周岗泉等报道，抗青枯病的番茄品种中内生细菌的含量明显高于感病品种，番茄青枯病的抗性可能与内生细菌的含量和拮抗菌的数量有关23]。周金鑫等报道，植物与病原菌相互作用的过程中，植物能感受病原菌的入侵并激活多种防御反应24-25]。白叶枯病病菌诱导水稻产生系统抗性，植物体内的生理生化发生了改变26]，内生细菌与植物在长期的共同进化中形成了一种微妙的协同关系27-29]，植物对病害产生的应激反应也体现在植物与内生菌组成的微生态环境的变化上，导致拮抗菌数量增多，但这种推测有待于进一步研究。

Sun等使用16S rDNA序列分析了2种水稻品种根部内生细菌的多样性，鉴定出水稻内生细菌有52个操作分类单元（operational taxonomic units，简称OTU），包括寡养单胞菌属、肠杆菌属（Enterobacter）、泛生菌属（Pantoea）、假单胞菌属、伯克氏菌属（Burkholderia）等属，优势类群为寡养单胞菌属30]。刘云霞等鉴定出水稻内生细菌的类群有芽孢杆菌属、黄单胞菌属（Xanthomonas）、肠杆菌属和假单胞菌属等4个属，优势属群为芽孢杆菌属31]。本研究采用16S rDNA序列鉴定出对水稻白叶枯病病菌具有拮抗作用的内生细菌共包含17个属，其中优势菌属为芽孢杆菌属。因此，从水稻内生细菌中筛选具有拮抗作用的芽孢杆菌作为防治水稻病害的生防菌具有广阔的应用前景，并为水稻白叶枯病的微生态治理提供了参考。

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