苦荞麦活性肽饮品抗疲劳及抗氧化功效研究

方玉梅，谭萍，周斯弼

（六盘水师范学院，贵州六盘水553004）

苦荞麦活性肽饮品抗疲劳及抗氧化功效研究

方玉梅，谭萍，周斯弼

（六盘水师范学院，贵州六盘水553004）

以昆明小鼠为研究对象，经连续灌胃苦荞麦活性肽饮品30 d后进行负重游泳试验，测定其负重游泳时间及血清中的酸脱氢酶、尿素氮、乳酸、肝糖原。采用同样方法进行抗氧化试验，测定小鼠肝脏总抗氧化活力与总超氧化物歧化酶（SOD）活力。结果表明，与对照组相比，灌胃苦荞麦活性肽饮品后昆明小鼠的负重游泳存活时间明显延长，负重游泳运动后有效降低血清乳酸与尿素氮水平、提高肝糖原水平及乳酸脱氢酶的含量，且随灌胃剂量的增加其效果越明显。在抗氧化动物试验中，发现苦荞活性肽饮品可以有效提高小鼠肝脏总抗氧化活力与总超氧化物歧化酶（SOD）活力，且随灌胃剂量的增加其效果愈明显。说明苦荞麦活性肽饮品具有良好的抗疲劳和抗氧化作用，今后可开发为解除疲劳、延缓衰老的保健饮品。

苦荞麦；活性肽饮品；抗疲劳；抗氧化

苦荞麦[Fagopyrum tataricum（L.）Gaertn.]，属蓼科荞麦属植物，俗称苦荞。一年生草本植物。生长在田边、路旁等潮湿地带。苦荞麦是甚少的天然药食两用作物[1]。

最近研究表明，活性肽在组织水平上可引起机体的生物学效应。研究人员发现，从一些食物蛋白的酶水解产物中分离出的多种小肽具有调节植物神经系统，活化细胞免疫功能，改善心血管功能和抗衰老等生理活性。最近，在医学上还发现，饮食中的小肽（2个～3个氨基酸）和大肽（10个～51个氨基酸）能够完整地通过肠道，由肠道直接吸收，小肽吸收速度要比相同组成的游离氨基酸快，利用率高；另外小肽还具有低抗原性，不会产生过敏反应[2-3]。

苦荞麦活性肽是苦荞麦蛋白粉经蛋白酶水解后生成的小肽和氨基酸的混合物，它更易被人体消化吸收[4]。近年国内外科研人员不断发现由苦荞麦粉水解制得的水解产物，有降血液、肝脏胆固醇，抑制体内脂肪蓄积，促进排泄、改善便秘，抑制肿瘤、延缓衰老，抑制有害物的吸收等作用，国外将之视为“高级营养保健品”[5-9]。因此，随着人们对苦荞麦研发的深入，它的营养价值和保健功能将会被了解得越来越清楚，也将会越来越引起人们的重视。

在发达国家，含水解蛋白（肽）的产品已广泛应用于运动员、婴幼儿、老人、病人康复的饮食中。我国活性肽饮品较少，且多以大豆活性肽、乳源活性肽、玉米活性肽为主。仅周小理[10]等对制备苦荞活性肽液的工艺条件和苦荞活性肽营养饮品的配方进行了初步研究，并未对活性肽粉进行脱苦处理，也未对活性肽饮品的安全性及功能性进行测评；苦荞麦活性肽饮品至今未见上市。

本试验通过小鼠负重游泳试验和生化指标的检测对实验室制备的苦荞麦活性肽饮品的抗疲劳及抗氧化作用进行研究，观察该饮品的抗疲劳能力，并探讨其可能的机制。

1 试验材料与设备

1.1 试验试剂

肝/肌糖原试剂盒（批号：20161207）、SOD试剂盒（测总，批号：20161203）、乳酸脱氢酶（LDH）试剂盒（批号：20161208）、乳酸（LD）测试盒（批号：20161212）、尿素氮（BUN）试剂盒（批号：20161206）、总抗氧化能力（T-AOC）试剂盒（批号：20161212）：南京建成生物工程生物研究所；生理盐水（批号：H15082307）：广西浦北药业有限公司；硫酸（批号：20141201）：重庆川东化工（集团）有限公司；冰醋酸（批号：20141108）：重庆茂业化学试剂有限公司。

1.2 试验仪器

电热恒温水槽：上海齐欣科学仪器有限公司；紫外可见分光光度计：上海元析仪器有限公司；BSA223S电子天平：赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；Microfuge 20R离心机：德国Bekman coulter，Inc公司；-80℃超低温保存箱：青岛海尔特种电器有限公司；全波长酶标仪：ThermoFisher scientific公司。

1.3 受试动物

健康昆明种小鼠：体重18 g～22 g，雌雄各半，Ⅱ级清洁级实验动物，由贵州医科大学实验动物中心提供，合格证号：SCXK（黔）2012-0001。

2 试验条件

健康昆明种小鼠，雌雄分笼饲养，小鼠每笼5只，由专人饲养管理。动物室光照充足，通风和空调设备良好，实验室环境温度18℃～25℃，相对湿度50%～70%，实验室按常规定期消毒。饲以贵州医科大学实验动物中心的小鼠全价颗粒饲料，自由饮水。

3 试验方法

3.1 苦荞麦活性肽饮品制备工艺流程

3.2 负重游泳实验[11]

健康昆明种小鼠50只，体重18 g～22 g，雌雄各半，按体重随机分为5组，每组10只。分别为对照组（等体积双蒸水），低剂量组（饮品2倍浓缩液）；中剂量组（饮品4倍浓缩液），高剂量组（饮品8倍浓缩液）。每日灌胃给药一次，给药容积10 mL/kg，连续给药30 d。末次给药30 min后，将小鼠尾根部负荷5%体重橡皮泥，置于50 cm×40 cm×60 cm有机玻璃槽中，水深35 cm，水温（25±0.5）℃，每个水槽每次每组小鼠放一只，并做好标记，记录小鼠自游泳开始至死亡的时间，作为小鼠的游泳时间。

3.3 抗疲劳功能实验[11]

健康昆明种小鼠50只，体重18 g～22 g，雌雄各半，分组及给药同3.2。末次给药30 min后，将小鼠置于30℃水中不负重游泳至将要沉落，休息60 min，摘眼球取血，静置30 min，1 500 r/min离心15 min，取血清置-80℃保存待测。引颈脱臼处死小鼠，取肝脏，预冷磷酸缓冲液（PBS）洗净残血，滤纸吸干水分，-80℃保存待测。分别测定乳酸脱氢酶（LDH）活力（微板法）、血清尿素氮（BUN）含量（脲酶法）、肝糖原含量（比色法）、乳酸（LD）含量（比色法）。

3.4 活性肽饮品肝脏总抗氧化活力与SOD活力测定

健康昆明种小鼠50只，体重18 g～22 g，雌雄各半，分组及给药同3.2。末次给药30 min后，摘取眼球取血，血液静置30 min后，1 500 r/min离心15 min，取血清，置-80℃保存待测。引颈脱臼处死小鼠，取肝脏，4℃磷酸缓冲液（PBS）洗净残血，滤纸吸干水分，-80℃保存待测。分别测定肝脏总抗氧化能力（T-AOC）（比色法）、总超氧化物歧化酶（SOD）活力（羟胺法）

4 结果与分析

4.1 负重游泳实验

小鼠负重游泳实验结果见表1。

表1 苦荞麦活性肽饮品对小鼠负重游泳时间的影响（±s，n=10）Table 1 Effect of tartary buckwheat bioactive peptide beverage on loaded swimming time in mice

表1 苦荞麦活性肽饮品对小鼠负重游泳时间的影响（±s，n=10）Table 1 Effect of tartary buckwheat bioactive peptide beverage on loaded swimming time in mice

注：与对照组比较，*P＜0.05。

组别 剂量 游泳时间/s对照 双蒸水 4 348.86±1 163.98低剂量 2倍浓缩液 5 407.38±1 664.85中剂量 4倍浓缩液 7 485.00±3 496.31*高剂量 8倍浓缩液 7 754.33±2 258.17*

灌胃苦荞麦活性肽饮品后昆明小鼠的负重游泳时间明显延长，且呈灌胃剂量越高昆明小鼠负重游泳时间越长的变化趋势，其中，中剂量组、高剂量组的昆明小鼠的负重游泳时间显著延长（P＜0.05），表明苦荞麦活性肽饮品可有效提高小鼠的耐力和运动能力。

4.2 抗疲劳功能实验结果[11]

试验结果如表2所示，苦荞麦活性肽饮品各剂量组可不同程度升高小鼠LDH、降低BUN、升高小鼠肝糖原含量、降低血清乳酸含量，与对照组比较差异显著（P＜0.05，P＜0.01）。

表2 苦荞麦活性肽饮品对小鼠BUN、LD、LDH及糖原含量的影响（±s，n=10）Table 2 Effect of tartary buckwheat bioactive peptide beverage on BUN，LD，LDH and glycogen content in mice（±s，n=10）

表2 苦荞麦活性肽饮品对小鼠BUN、LD、LDH及糖原含量的影响（±s，n=10）Table 2 Effect of tartary buckwheat bioactive peptide beverage on BUN，LD，LDH and glycogen content in mice（±s，n=10）

注：与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

组别剂量LDH/（U/L）BUN/（mmol/L）肝糖原/（mg/g）LD/（mmol/L）对照 双蒸水 6 153.38±936.56 14.71±4.02 4.78±2.95 11.07±2.29低剂量 2倍浓缩液 8 348.15±1 890.80** 11.64±2.48* 8.08±2.44* 9.02±1.36*中剂量 4倍浓缩液 19 822.22±12 847.06** 11.60±2.68* 8.28±1.78* 8.52±1.81*高剂量 8倍浓缩液 21 194.44±6 530.88** 11.03±2.78* 8.58±3.62* 8.30±1.72*

4.2.1 苦荞麦活性肽饮品对昆明小鼠运动后乳酸脱氢酶（LDH）活力的影响

乳酸脱氢酶（LDH）是催化乳酸和丙酮相互转化的同工酶，属于氢转移酶。该酶存在于所有动物的组织中，在肝脏中活性最高。乳酸脱氢酶的活性增高可以加速乳酸的清除也是提高机体抗疲劳的一种机制。由表2可知，灌胃苦荞麦活性肽饮品昆明小鼠运动后的乳酸脱氢酶水平明显高于对照组，其中，低剂量组、中剂量组、高剂量组均极显著高于对照组，说明苦荞麦活性肽饮品可有效提高昆明小鼠的乳酸脱氢酶的活性，加速乳酸的清除，提高小鼠的抗疲劳性。

4.2.2 苦荞麦活性肽饮品对昆明小鼠运动后血清尿素氮的影响

与对照组相比，灌胃苦荞麦活性肽饮品的昆明小鼠运动后，其血清尿素氮水平明显降低，且随灌胃剂量的增加而逐渐降低（表2），且低剂量组、中剂量组、高剂量组均显著低于对照组，说明苦荞麦活性肽饮品可降低昆明小鼠剧烈运动后体内血清尿素氮的积累。

4.2.3 苦荞麦活性肽饮品对昆明小鼠运动后血清乳酸的影响

苦荞麦活性肽饮品对昆明小鼠运动后血清乳酸的影响与其对昆明小鼠运动后血清尿素氮的影响一致，即灌胃苦荞麦活性肽饮品的昆明小鼠运动后，其血清乳酸水平明显降低，且随灌胃剂量的增加而逐渐降低（表2），且低剂量组、中剂量组、高剂量组均显著低于对照组，说明苦荞麦活性肽饮品还可降低昆明小鼠剧烈运动后体内血清乳酸的积累。

4.2.4 苦荞麦活性肽饮品对昆明小鼠运动后肝糖原的影响

肝糖原是由许多葡萄糖分子聚合而成葡萄糖聚合物，并以糖原的形式储存于肝脏，当机体需要时可分解成葡萄糖，转化为能量。由表2可知，灌胃苦荞麦活性肽饮品昆明小鼠运动后的肝糖原水平明显高于对照组，且随灌胃剂量的增加而逐渐升高，且低剂量组、中剂量组、高剂量组均显著高于对照组，说明苦荞麦活性肽饮品可有效提高昆明小鼠的肝糖原水平，为其剧烈运动补充能量。

4.3 苦荞麦活性肽饮品肝脏总抗氧化活力与SOD活力测定

苦荞麦活性肽饮品对小鼠T-AOC及SOD活力的影响见表3。

表3 苦荞麦活性肽饮品对小鼠T-AOC及SOD活力的影响（±s，n=10）Table 3 Effect of tartary buckwheat bioactive peptide beverage on T-AOC and SOD activity in mice（±s，n=10）

表3 苦荞麦活性肽饮品对小鼠T-AOC及SOD活力的影响（±s，n=10）Table 3 Effect of tartary buckwheat bioactive peptide beverage on T-AOC and SOD activity in mice（±s，n=10）

注：与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01。

组别剂量T-AOC/（U/mg蛋白）SOD/（U/mL）对照 双蒸水 77.05±10.31 279.42±33.05低剂量 2倍浓缩液 88.14±8.16* 321.93±25.68*中剂量 4倍浓缩液 89.30±7.32* 331.35±34.00**高剂量 8倍浓缩液 90.23±8.87* 342.76±33.34**

由表3可知，苦荞麦活性肽饮品低、中、高剂量组可显著升高小鼠T-AOC，且随灌胃剂量的增加而逐渐升高，与对照组比较，差异显著（P<0.05）。苦荞麦活性肽饮品各剂量组显著升高小鼠SOD活性，与对照组比较差异显著（P<0.05，P<0.01）。且随灌胃剂量的增加而逐渐升高，中、高剂量组的SOD活性加强，达极显著水平；可见，苦荞麦活性肽饮品可有效增强肝脏总抗氧化能力（T-AOC）及体内的SOD活力，具有良好的抗氧化作用。

5 讨论与结论

通过测定机体连续运动的时间，可以反映机体的耐力水平[12]，灌胃苦荞麦活性肽饮品后小鼠负重游泳时间明显延长，表明苦荞麦活性肽饮品可以使小鼠的运动耐力提高，这是延缓体力性疲劳产生最直接的表现，初步说明该饮品具有抗疲劳作用。

由于剧烈运动或长时间运动，机体处于相对缺氧状态，导致糖酵解加快而产生大量乳酸。血乳酸大量堆积是引起机体疲劳的重要原因[13]，即运动后血清乳酸水平能客观反映机体无氧供能的比率，是无氧耐力或机体疲劳的常用衡量指标[14]。运动后能量代谢产生血乳酸含量的多少能从一定程度上反映机体的疲劳程度，产生的血乳酸越少，表示动物的促进体力性疲劳消除能力就越强。因此，抑制乳酸产生或加快其清除，可有效维持内环境稳定，从而延缓疲劳或加快疲劳消除。小鼠经灌胃处理后，乳酸脱氢酶的活性明显升高，血乳酸含量明显降低，说明苦荞麦活性肽饮品具有促进疲劳消除的作用[15]。

在氧充足条件下，糖原给机体最先提供能源的物质，因此增加体内肝糖原的储备量，可以减少在剧烈运动中蛋白质的氧化分解，保护各项生理活动中蛋白质的正常代谢，提高机体对过量负荷的适应能力，使机体耐力增强。能量代谢中主要的能量来源是肝糖原，动物自身肝糖原的多少可以反映机体延缓体力性疲劳产生的能力，肝糖原越多，动物耐受疲劳的能力就越强。小鼠经灌胃处理后，肝糖原含量明显高于对照组，说明苦荞麦活性肽饮品具有增强小鼠耐受疲劳能力的作用[16-17]。

当机体长时间运动，通过糖、脂肪代谢不能获得足够能量来源时，机体内的蛋白质分解代谢会增强且伴随血清尿素氮产生增多。机体内血清尿素氮水平会随运动负荷的增加而上升，机体对运动负荷的适应力越差，其血清尿素氮的增加就越明显[13]。小鼠经灌胃处理后，血清尿素氮含量明显降低，说明苦荞麦活性肽饮品可以提高小鼠对运动负荷的适应能力，具有促进疲劳消除的作用。

机体的衰老是一个复杂过程，目前“自由基”学说受到普遍重视。该学说认为，自由基及其代谢产物引起的脂质过氧化可导致机体衰老。随着年龄的增长，机体自身的抗氧化系统功能下降，导致体内自由基代谢平衡逐渐紊乱，机体内的自由基积累增多。T-AOC是衡量生物机体内抗氧化能力的最佳指标之一，同时机体T-AOC的强弱直接影响机体的健康，T-AOC反映机体抗氧化防御体系对体内自由基的代谢状态[18]。机体体内抗氧化剂之间的相互协作、细胞外自由基的清除反应以及生物的衰老、疾病等都是能够通过体内T-AOC来做出反映[19-20]。

SOD为体内主要抗氧化酶。SOD能催化超氧阴离子发生歧化反应，使其生成H2O2，进一步转变成H2O和O2，从而清除自由基；因此，SOD活力或水平反映了机体清除氧自由基的能力。机体组织中SOD水平随着动物年龄的增长而逐渐下降。

在抗氧化试验中，灌胃苦荞麦活性肽饮品可有效提高肝脏T-AOC血清及SOD水平，说明苦荞麦活性肽饮品可增强小鼠机体的抗氧化功能。

本研究以昆明小鼠为研究对象，经连续灌胃苦荞麦活性肽饮品30 d后进行负重游泳实验，结果表明，苦荞麦活性肽饮品能有效延长昆明小鼠的负重游泳存活时间、降低运动后的血清乳酸与尿素氮水平、提高肝糖原水平，增加乳酸脱氢酶的含量，提高超氧化物歧化酶（SOD）的活性，提高总抗氧化能力。且随灌胃剂量的增加其效果愈明显，与王炜等[21]的研究结果一致，说明苦荞麦活性肽饮品具有良好的抗疲劳和抗衰老功效，今后可开发为解除疲劳、延缓衰老的保健饮品。

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Study on Anti-fatigue and Anti-oxidative Effects of Tartary Buckwheat Bioactive Peptide Beverage

FANG Yu-mei，TAN Ping，ZHOU Si-bi
（Liupanshui Normal College，Liupanshui 553004，Guizhou，China）

With Kunming white mice as experimental animals，the mice were gavaged with tartary buckwheat bioactive peptide beverage.After 30 days，loaded swimming experiment was conducted to detect loaded swim－ming time，content of blood lactic dehydrogenase，urea nitrogen，lactic acid and hepatic glycogen.Using the same method，anti-oxidative experiment was conducted to detect the content of total antioxidant activity and SOD activity in liver.Compared with the control group，the loaded swimming survival time of Kunming white mice injected with tartary buckwheat bioactive peptide beverage was prolonged obviously，the content of serum lactic acid and urea nitrogen was decreased effectively，and the content of hepatic glycogen and lactic dehydrogenase was increased after the loaded swimming.In the anti-oxidative animal experiment，it was found that the level of total antioxidant activity and SOD activity in liver of mice could be increased by tartary buckwheat bioactive peptide beverage.Effects were more obvious with the increasing of dosage.Due to good anti-fatigue and anti-oxidative effects，tartary buckwheat bioactive peptide beverage can be developed to be health beverage with anti-fatigue and anti-aging effects.

tartary buckwheat；bioactive peptide beverage；anti-fatigue；anti-oxidative

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.24.037

贵州省“125计划”重大科技专项（黔教合重大专项字[2014]038号）；贵州省科技厅技术基金项目（黔科合J字LKLS[2013]05号）

方玉梅（1982—），女（布依），副教授，硕士研究生，从事植物生理学与分子生物学的教学与研究

2017-05-11