树脂包埋半薄切片在视神经组织学和免疫组织化学研究中的应用

吴洪娟，李桂芝，周力，尤敏，高峰，赵岩松

（潍坊医学院1形态学实验室，2附属医院眼科，潍坊261053）

树脂包埋半薄切片在视神经组织学和免疫组织化学研究中的应用

吴洪娟1，李桂芝1，周力1，尤敏1，高峰1，赵岩松2*

（潍坊医学院1形态学实验室，2附属医院眼科，潍坊261053）

目的探讨半薄切片在视神经组织学和免疫组织化学研究中的应用，寻找一种视神经形态学研究和疾病诊断的有效方法。方法健康Sprague-Dawley大鼠视神经分别行树脂包埋制成半薄切片与石蜡包埋制成石蜡切片，分别采用HE、甲苯胺蓝染色及髓鞘碱性蛋白（myelin basic protein, MBP）免疫组织化学方法染色，光学显微镜下观察并比较半薄切片与石蜡切片染色结果的差异。结果石蜡切片HE和甲苯胺蓝染色均显示视神经髓鞘不着色，MBP免疫组织化学染色示MBP阳性着色较重，着色较紊乱，髓鞘着色不清晰。半薄切片HE及甲苯胺蓝染色均显示髓鞘呈环形，着色清晰，颜色对比鲜明；MBP免疫组化染色结果可见髓鞘呈环形，非特异性染色不明显，阳性对比显著，可清晰显示髓鞘结构。结论半薄切片在视神经组织学和免疫组织化学研究中优于石蜡切片，可用于视神经疾病的诊断和研究。

视神经；树脂；半薄切片；组织学；免疫组织化学；

组织学和免疫组织化学研究通常都需要将组织制成薄的切片，而石蜡切片是最基本、应用最广泛的组织切片技术，是目前临床病理诊断和科学研究的重要手段。视神经疾病的诊断和研究也离不开切片和组织染色。由于视神经组织较小，外面有神经鞘膜包裹，制备石蜡切片时经过脱水透明易产生收缩并变脆，切片容易裂或破碎。本研究采用SPI-Pon环氧树脂包埋大鼠视神经，并制成1μm半薄切片，进行HE染色、甲苯胺蓝染色和免疫组织化学染色，并与石蜡切片染色效果进行观察比较，以期为视神经组织寻找最佳的包埋与切片方法。

材料与方法

1 主要设备与试剂

组织切片机（德国，Leica RM 2235型）；正置光学研究级显微镜（日本，OLYMPUS，BX 51）；超薄切片机（奥地利，Ultracut E型）。

HE染液、甲苯胺蓝（Solarbio公司）；兔抗髓鞘碱性蛋白（MBP）一抗（武汉博士德生物试剂有限公司）；二抗试剂盒、DAB显色剂（北京中杉金桥生物科技有限公司）。

甲苯胺蓝染液的配制[1]：四硼酸钠1g，用100 ml双蒸水加热溶解后，再加入甲苯胺蓝1g，待全部溶解后过滤，室温保存如配制时间较久，其表面会形成一层氧化膜，影响染色，可用前再过滤。

2 动物及实验分组

成年健康SD大鼠10只，购自青岛市实验动物和动物实验中心[SCXK（鲁）20140001]，体重为200～230g，雌雄不拘，随机分为两组：半薄切片组与石蜡切片组，每组各5只。

3 样品采集与制备

10%水合氯醛腹腔麻醉后，依次0.9%的生理盐水、4%多聚甲醛心脏灌注后，立即摘除眼球，切下视神经，半薄切片组迅速放入3%戊二醛固定液固定，行常规透射电镜样品制备，SPI-Pon环氧树脂包埋，超薄切片机1mm切片，置于涂有APES的载玻片上，加热展平烘干备用；石蜡切片组放入4%多聚甲醛固定液，行常规石蜡包埋，并制成 4mm切片，捞于涂有APES的载玻片上，60～70℃烤片2h备用。

4 HE染色

石蜡切片：切片脱蜡至水，苏木素染色5min，自来水洗；1%盐酸酒精分化5s，自来水洗；伊红染色1min，水洗；酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。

半薄切片：滴加2.5%过碘酸，60℃15min，水洗烤干；滴加苏木素染液，60℃30min，水洗烤干；滴加1%伊红染液，60℃5min，水洗烤干；二甲苯透明，中性树胶封片。

5 甲苯胺蓝染色

石蜡切片：切片脱蜡至水，甲苯胺蓝液30min，稍水洗；冰醋酸液分化3s，蒸馏水中洗两次，冷风吹干；二甲苯透明，中性树胶封片。

半薄切片：滴加甲苯胺蓝染液，60℃30s，水洗，烤干，二甲苯透明，中性树胶封片。

6 免疫组织化学染色

石蜡切片：脱蜡至水，PBS洗；0.3%H2O25min，0.01mol/L PBS洗；正常血清室温10min；一抗室温30min、4℃冰箱过夜、室温复温30min，0.01mol/L PBS洗；二抗37℃ 孵育60 min，0.01mol/L PBS洗；DAB镜下显色，至阳性表达呈棕黄色颗粒终止显色，去离子水充分冲洗；酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。

半薄切片：2.5%过碘酸脱树脂，60℃15min，水洗，PBS洗；余同石蜡切片免疫组织化学染色方法。

结 果

HE染色石蜡切片髓鞘不着色，分界不清，少突胶质细胞胞浆红色，核紫蓝色，形状不规则散在（图1A）。半薄切片神经髓鞘横切面呈紫蓝色大小不等的环状，少突胶质细胞核呈蓝色，核仁深染清晰，间质淡紫色，分界清楚（图1B)。

图1 视神经石蜡切片与半薄切片HE染色比较。A，石蜡切片HE染色，髓鞘不着色，细胞核呈蓝紫色；B，半薄切片HE染色，髓鞘呈紫红色、大小不等的环形，间质不着色，分界清楚；比例尺，10μmFig. 1 The comparison between paraffin and semi-thin section of optic nerve using HE staining. A, HE stained paraffin section. Myelin sheaths were not well stained. Nuclei were counter-stained blue-purple; B, HE stained semi-thin section. Myelin sheaths in variable sizes were stained purple. Stroma with clear boundary was not stained; scale bar, 10μm.

甲苯胺蓝染色石蜡切片髓鞘不着色，只呈现淡蓝色网状结构，与间质分界不清；少突胶质细胞散在，形态不规则，核深蓝色（图2A）。半薄切片神经髓鞘横切面呈深蓝环状，大小不等，厚薄不一，少突胶质细胞核淡染，胞浆深蓝色，间质淡染，分界清楚（图2B）。

图2 视神经石蜡切片与半薄切片甲苯胺蓝染色比较。A，石蜡切片甲苯胺蓝染色, 髓鞘不着色，细胞核深蓝色；B，半薄切片甲苯胺蓝染色，髓鞘呈深蓝色、大小不等的环形，间质淡染，分界清楚；比例尺，10μmFig. 2 The comparison between paraffin and semi-thin section of optic nerve using toluidine blue staining. A, toluidine blue stained paraffin section.Myelin sheaths were poorly stained and Nuclei were counter-stained dark blue; B, toluidine blue stained semi-thin section. Myelin sheaths in variable sizes were stained dark blue. Stroma with clear boundary was not stained; scale bar, 10μm.

MBP免疫组织化学染色 石蜡切片呈棕黄色，阳性着色多，显示着色较紊乱，髓鞘着色不清晰（图3A）。半薄切片可见髓鞘呈环形，棕黄或棕褐色，非特异性染色不明显，间质不着色，分界清楚（图3B）。

图3 视神经石蜡切片与半薄切片MBP免疫组化染色比较。A，石蜡切片MBP免疫组化染色，MBP阳性呈棕黄色，髓鞘着色不清晰；B，半薄切片MBP免疫组化染色，髓鞘呈环形，棕黄或棕褐色，非特异性染色不明显，间质不着色；比例尺，10μmFig. 3 The comparison between paraffin and semi-thin sections of optic nerve using MBP staining. A, MBP stained paraffin section. Myelin sheaths were stained brown however lacked clarity; B, MBP stained semi-thin section. Myelin sheaths were stained brown in clear and circular structure. The non-specific staining was insignificant; scale bar, 10μm

讨 论

环氧树脂包埋半薄切片是电镜样品制备过程中的重要环节，切片厚度为0.5～2μm，主要用于电镜超薄切片的准确定位，避免超薄切片的盲目性，提高电镜观察的准确性。环氧树脂包埋块具有较高的硬度和较好的韧性，切片用的玻璃刀或钻石刀也更加锋利，可以制作0.5～1μm的切片，由于切片薄，样品结构保存好，图像的清晰度、分辨率远优于石蜡切片，有利于获得高质量的光镜图像，被广泛应用于组织学、细胞学的教学、科研和病理诊断[2]。

石蜡切片是形态学研究和病理学诊断的基本技术，应用广泛。由于包埋剂石蜡硬度的局限性，切片厚度一般只能切3～4μm以上。视神经组织较小，有神经鞘膜包裹，石蜡不容易浸透，且经过脱水、透明易收缩和变脆，造成切片时从鞘膜处脱离、破碎或不易切片。

我们将视神经用环氧树脂包埋进行半薄切片，切片完整，结构清晰、保存完好，与石蜡包埋切片同时进行了HE、甲苯胺蓝髓鞘染色和MBP免疫组化染色，结果显示，石蜡切片HE染色和甲苯胺蓝染色，都能清晰显示神经胶质细胞，但髓鞘都不着色，这主要是由于视神经的主要成分是类脂，在常规包埋处理的标本上，因髓鞘中的类脂被溶解，故染色时髓鞘不着色[3]。而半薄切片由于标本处理时使用了锇酸固定，对髓鞘的类脂成分有很好的固定作用，且经锇酸固定后的类脂质组织不会被脂溶性溶剂溶解[4]，所以半薄切片HE染色和甲苯胺蓝染色都能较好地显示神经髓鞘。视神经半薄切片进行免疫组化染色也得到较好的结果，阳性反应物清晰，非特异性着色少，对所检测成份存在位点更明确，背景着色较石蜡切片明显减少，对比度明显提高，特异性好，这可能与半薄切片切片薄、组织重叠少、抗原位点暴露更充分有关系。

实验结果表明，视神经用树脂包埋半薄切片，组织学染色着色鲜明，结构清晰，能显示石蜡切片不能显示的微细结构；HE染色和甲苯胺蓝染色各具特点：甲苯胺蓝染色方法简便，易于操作，不需要脱树脂，染色几十秒即可清晰地显示髓鞘和神经细胞。苏木素染色步骤较多，染色时间较长，结果清晰，对比度好，不易退色。两种方法均可用于视神经髓鞘的研究、病理诊断及教学切片的制备。

由于半薄切片的包埋介质是树脂，其封闭了组织细胞的着色性，同时锇酸固定后的黑色也影响染色效果，因此半薄切片染色前需要腐蚀掉树脂和锇酸。用2.5%过碘酸能较好地脱掉树脂和锇酸，增强着色性又不损伤组织结构，是半薄切片染色前较好的脱树脂方法[5]。为增加染液的穿透能力和着色性，半薄切片染色时需要加热，所以染色要在湿盒中进行，以防止加热时染液被烤干。

[1] 刘冬娟，祝素文，李艳杰. 硼砂甲苯胺蓝染液在半薄切片染色上的应用. 中国医科大学学报，2004，33（1）：33.

[2] 孙淑清，曲宝清，孙异临，等. 树脂薄切片在周围神经病变诊断中的应用. 中华病理学杂志，2002，31（1）：75-76.

[3] 高英茂. 组织学与胚胎学. 北京：科学出版社，2007，90.

[4] 顾兵，金建波，李华南，等。神经组织染色方法的研究概况. 中国药理学通报，2011，27（10）：1472-1475.

[5] 吴洪娟，周力，李桂芝，等. 肥大细胞电镜半薄切片染色. 电子显微学报，2012，31（5）：452-454.

Application of resin-embedded semi-thin section in histological and immunohistochemical study of optic nerve

Wu Hongjuan1, Li Guizhi1, Zhou Li1, You Min1, Gao Feng1, Zhao Yansong2*
(1Morphological Laboratory,2Department of Ophthalmology, Weifang Medical University, Weifang 261053, China)

ObjectiveTo explore the application of resin-embedded semi-thin section in histological and immunohistochemical study of optic nerve morphology and disease diagnosis.MethodsSprague-Dawley rat optic nerve specimens were prepared using either resin embedded semi-thin section or paraffin embedded section. The effects of two methods on HE, toluidine blue and myelin basic protein (MBP) immunohistochemical staining were evaluated and compared using light microscope.ResultsIn paraffin sections, optic nerve myelin sheaths were poorly stained with HE or toluidine blue, while MBP over-stained tissues and made the tissue structures especially myelin sheaths hard to distinguish. In semi-thin sections, both toluidine blue and HE stained circular myelin sheaths with clarity and strong contrast. MBP also stained circular myelin sheath clearly with reduced non-specific binding.ConclusionSemi-thin section is superior to paraffin section in the histological and immunohistochemical staining of optic nerve, therefore may be used in the diagnosis and research of optic nerve diseases.

Optic nerve; resin; semithin sections; histology; immunohistochemistry

R331

A DOI：10.16705/ j. cnki. 1004-1850. 2017. 05. 017

2017-06-23

2017-10-11

山东省自然科学基金项目（ZR2013HL067）；山东省医药卫生科技发展计划项目（2013WS0295）

吴洪娟，女（1965年），汉族，高级实验师

*通讯作者(To whom correspondence should be addressed)：zhaoyansong74@163.com