干扰linc00152抑制胶质瘤细胞增殖与侵袭

罗冬冬，彭 彪，罗爱萍，胡 骕，赵海林，李 丹

(广州医科大学附属肿瘤医院神经外科1、肝胆外科2，广东 广州 510095)

干扰linc00152抑制胶质瘤细胞增殖与侵袭

罗冬冬1，彭 彪1，罗爱萍2，胡 骕1，赵海林1，李 丹1

(广州医科大学附属肿瘤医院神经外科1、肝胆外科2，广东 广州 510095)

目的 观察干扰linc00152的人胶质瘤细胞株U251的增殖与侵袭情况。方法 培养胶质瘤U251细胞，将U251细胞分为观察组和对照组，观察组转染linc00152-shRNA，对照组转染control-shRNA，采用qRT-PCR法检测两组U251细胞中linc00152 mRNA的表达，采用MTT法观察两组细胞增殖能力，侵袭实验检测两组细胞的侵袭能力。结果 qRT-PCR结果显示，观察组U251细胞中linc00152的mRNA表达量为(0.313±0.020)，明显少于对照组的(1.017±0.082)，差异有显著统计学意义(P＜0.01)；MTT结果显示，观察组的U251细胞的OD值为(0.444±0.032)，少于对照组的(0.679±0.052)，差异具有统计学意义(P＜0.05)；侵袭实验结果显示，观察组穿过基质胶的U251细胞数量为(66.9±9.1)，明显少于对照组的(146±12.2)，差异具有显著统计学意义(P＜0.01)。结论在人胶质瘤细胞株U251中敲低linc00152能抑制细胞的增殖与侵袭。

胶质瘤；linc00152；增殖；侵袭

人脑胶质瘤是颅内最常见的原发性肿瘤，其中恶性胶质瘤约占60%。手术结合放、化疗是脑胶质瘤治疗的主要手段[1]。虽然目前随着肿瘤治疗研究的发展，脑胶质瘤的诊断和治疗不断进步，但其中位生存期仍没有明显提高，仍然只有手术后的9～12个月。因此，通过现代分子生物学手段阐明脑胶质瘤的发病机制，寻找脑胶质瘤诊断标志物以及潜在的基因治疗靶点，以便对胶质瘤患者进行早期诊断、提高胶质瘤患者疗效、改善胶质瘤患者预后的突破口。

长链非编码RNA(long noncoding RNA，lncRNA)是长度超过200个核苷酸的非编码RNA，不但在正常生理过程中发挥重要作用，而且也参与人类疾病如癌症的发生、发展、转移，已经成为近期深入研究的热点课题[2]。linc00152是lncRNA中的一个成员之一，有研究报道，linc00152在多种癌症中表达上调并且与肿瘤的发展及患者的不良预后明显相关[3]，然而其在胶质瘤的作用至今仍未见报道。本研究观察了干扰linc00152的人胶质瘤细胞株U251的生长与侵袭情况。

1 材料与方法

1.1 试验材料 Lipofectamine 2000购自美国Invitrogen公司，linc00152-shRNA与control-shRNA由Invitrogen公司设计构建，RNA抽提试剂盒购于Applied Biosystems公司，MTT粉购自美国Sigma公司，Transwell小室购于美国BD公司。

1.2 linc00152-shRNA转染及细胞分组 培养胶质瘤U251细胞，将U251细胞分为观察组与对照组，按2 mL细胞悬液/孔接种于6孔板中，放置培养箱培养至细胞密度达50%左右进行转染。观察组转染linc00152-shRNA，对照组转染control-shRNA。用灭菌无酶水稀释linc00152-shRNA与control-shRNA质粒干粉，按说明配制成100 pmol/L溶液质粒备用。用不含血清的Opti-MEM培养液稀释5 μ L的lipofecta-min2000，两者分别混匀并室温孵育5 min后加入6孔板中继续培养48 h，收获细胞。

1.3 MTT法检测细胞增殖 消化上述两组细胞，取200 μL即5 000个细胞接种于96孔板中，设置6个复孔，培养48 h后取出加20 μL MTT液/孔，再继续培养4 h后取出加150 μL二甲基亚矾(DMSO)液/孔，低速振荡10 min，选择波长为570 nm，在酶标仪上测定各孔吸光值，实验重复3次。

1.4 Transwell侵袭实验 在Transwell小室中铺加适量基质胶稀释液，过夜并成膜。在上述两组细胞中分别取100µL即含1×105个细胞/mL的细胞稀释液接种至Transwell小室的上室，取500 μL含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液加至Transwell小室的下室，放置在37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养36 h后取出来，用棉签擦弃小室上腔残存的细胞，滴加磷酸盐缓冲液(PBS)轻洗两遍，再放置在4%多聚甲醛中浸泡5 min，以固定小室背面细胞，结晶祡染色背面细胞，磷酸盐缓冲液（PBS）液洗，倒置，晾干。光学显微镜下观察并摄相，随机选取4个高倍视野进行细胞计数，取平均值，实验重复3次。

1.5 统计学方法 应用SPSS13.0统计学软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差()表示，组间比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组U251细胞中linc00152的表达比较 qRT-PCR结果显示，实验组U251细胞中linc00152的mRNA表达量为(0.313±0.020)，与对照组的(1.017±0.082)比较，差异有显著统计学意义(t=8.987，P＜0.01)。

2.2 两组U251细胞增殖能力比较 MTT实验结果显示，实验组的U251细胞的OD值为(0.444±0.032)，与对照组的(0.679±0.052)比较，差异具有统计学意义(t=3.215，P＜0.05)。

2.3 两组U251细胞侵袭能力比较 Transwell侵袭实验结果显示，实验组穿过基质胶的U251细胞数量为(66.9±9.1)，与对照组的(146±12.2)比较，差异均具有显著统计学意义(t=8.318，P＜0.01)，见图1。

图1 linc00152-shRNA对胶质瘤U251细胞侵袭能力的影响（×100）

3 讨论

近年来基因组研究证明几乎所有的人类基因组都转录并产生大量的非编码RNA[2]，广泛参与人体生理、病理活动。lncRNA在肿瘤中的差异性表达与肿瘤的发生、发展密切相关，并且可能是肿瘤预后的一个独立预测因子，因此具有极为重要的潜在临床应用价值，有望成为肿瘤诊断的生物标志物及治疗的分子靶点。目前研究发现与胶质瘤相关的多个lncRNA中有lncRNA ZEB1-AS1和SPRY4-IT1可作为胶质瘤的预后分子，并且能促进胶质瘤细胞的侵袭与转移[3]；LincRNA MALAT1可通过抑制ERK/AKT信号通路抑制胶质瘤的生长与侵袭[4]；LincRNA NEAT1通过调控miR-499B-5P/C-Met轴调控胶质瘤的发生发展[5]。这些lncRNA与胶质瘤的发生发展、增殖、复发、诊断治疗及预后均有着一定的相关性。随着对IncRNA功能研究的不断深入，IncRNA与肿瘤发生发展关系的研究虽取得了瞩目的成果，然而大多数lncRNA的研究仍处于起始阶段，其生物学功能及分子调控机制不明。前期研究通过qRT-PCR技术检测发现linc00152在胶质瘤组织中表达明显下调。为进一步明确linc00152在人胶质瘤中的作用，本次研究首先通过转染技术将linc00152-shRNA转于人胶质瘤细胞株U251中，以敲低该细胞中linc00152的表达水平。qRT-PCR实验证实观察组linc00152的mRNA水平较对照组均明显下调，提示转染成功。接下来进一步采用MTT法、侵袭实验明确其对人胶质瘤细胞株U251增殖与侵袭的影响。MTT实验结果显示，在人胶质瘤细胞株U251中敲低linc00152后，细胞的增殖明显下降。而侵袭实验结果显示，在人胶质瘤细胞株U251中敲低linc00152后，细胞的侵袭作用亦明显减弱。

综上所述，在人胶质瘤细胞株U251中敲低linc00152能抑制细胞的增殖与侵袭，其具体机制有待进一步研究。本项目以前期的重要发现为基础，将进一步通过细胞实验、动物体内实验、临床标本等方面深入研究linc00152在胶质瘤发生、复发、耐药中的作用，为鉴定胶质瘤耐药、复发及预后预测标志物以及开发提高胶质瘤化疗敏感性的治疗方法奠定基础，具有潜在的临床应用价值。

[1]Wang HX,Xu T,Jiang Y,et al.The challenges and the promise of molecular targeted therapy in malignant gliomas[J].Neoplasia,2015,17(3):239-255.

[2]Siegel R,Ward E,Brawley O,et al.Cancer statistics,2011:the impact of eliminating socioeconomic and racial disparities on premature cancer deaths[J].CACancer J Clin,2011,61(4):212-236.

[3]Lv QL,Hu L,Chen SH,et al.A long noncoding RNA ZEB1-AS1 promotes tumorigenesis and predicts poor prognosis in glioma[J].International Journal of Molecular Sciences,2016,17(9):1431.

[4]Han Y,Wu Z,Wu T,et al.Tumor-suppressive function of long noncoding RNA MALAT1 in glioma cells by downregulation of MMP2 and inactivation of ERK/MAPK signaling[J].Cell Death&Disease,2016,7(3):e2123.

[5]Zhen L,Yunhui L,Hongyu D,et al.Long noncoding RNA NEAT1 promotes glioma pathogenesis by regulating miR-449b-5p/c-Met axis[J].Tumour Biology,2016,37(1):1-11.

Interference with linc00152 can inhibit glioma cell growth and invasion.LUO Dong-dong1,PENG Biao1,LUO

Ai-ping2,HU Su1,ZHAO Hai-lin1,LI Dan1.Department of Neurosurgery1,Department of Hepatobiliary Surgery2,Affiliated Cancer Hospital and Institute of Guangzhou Medical University,Guangzhou 510095,Guangdong,CHINA

Objective To observe the growth and invasion of human glioma cell line U251 interfered with linc00152.Methods Cultured glioma U251 cells were divided into the observed group and the control group.The observed group was transfected with linc00152-shRNA,and the control group was transfected with control-shRNA.The expression of linc00152 mRNA in U251 cells of the two groups was detected by quantitative reverse transcription-PCR(qRT-PCR)method.Tetrazolium-based colorimetric(MTT)assay was used to observe the proliferation ability of cells in the two groups.The invasive ability of the two groups cells was detected by invasion assay.Results QRT-PCR results showed that the expression of linc00152 mRNA of U251 cells in the observed group was(0.313±0.020),which was significantly lower than(1.017±0.082)in the control group(P＜0.01).MTT results showed that the OD value of U251 cells in the observed group was(0.444±0.032),which was significantly less than(0.679±0.052)in the control group(P＜0.05).Invasion assay results showed that the number of U251 cells passing through the matrix glue in the observed group was(66.9±9.1),which was significantly less than(146±12.2)in the control group(P＜0.01).Conclusion The knockdown of linc00152 in human glioma cell line U251 can inhibit cell proliferation and invasion.

Glioma;Iinc00152;Proliferation;Invasion

R730.264

A

1003—6350（2017）19—3097—02

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.19.001

广东省广州市医学重点学科建设项目；广州医科大学科研基金（编号：2015C39）

罗冬冬。E-mail：865656249@qq.com

2017-03-26)