发酵棕榈仁粕活性物质含量测定

刘春雨，刘 颖，王彦多，曹广超，王集会

(1.山东中医药大学 药学院，山东 济南 250355；2.山东中医药大学 实验中心，山东 济南 250355)

发酵棕榈仁粕活性物质含量测定

刘春雨1，刘 颖1，王彦多1，曹广超1，王集会2*

(1.山东中医药大学 药学院，山东 济南 250355；2.山东中医药大学 实验中心，山东 济南 250355)

对发酵棕榈仁粕水溶性蛋白及醇沉小肽，寡糖的含量测定。通过水提及醇沉法对发酵棕榈仁粕分别进行活性物质的提取，利用福林酚法对总蛋白及小肽进行含量测定，利用改良苯酚-硫酸法对寡糖进行含量测定。结果：通过对发酵棕榈仁粕活性物质含量测定，得出每克发酵棕榈仁粕中水提总蛋白含量为19.1579 mg，80%醇沉提取得到的小肽含量为14.5102 mg，80%醇沉提取得到的寡糖的含量为175.5923 mg，50%醇沉提取得到的寡糖含量为286.5267 mg。利用福林酚法对发酵棕榈仁粕水提及80%醇沉的总蛋白，小肽测定确定其具体含量；利用改良苯酚-硫酸法分别对50%，80%醇沉提取得到的寡糖含量测定，说明50%醇沉提取得到的寡糖含量要大于80%醇沉提取得到的寡糖含量。

发酵棕榈仁粕；水提醇沉；含量测定；福林酚法；改良苯酚—硫酸法

棕榈仁粕是棕油树上的棕果(Elaeis Guineensis)经机械榨取棕榈油后的副产品。它是高质量的家畜饲料，是适合大多数家畜的安全饲料，更可以替代谷物饲料。棕榈作为一种优良的饲料来源，经研究发现其中含有大量蛋白质物质，一些家畜必需氨基酸和丰富微量元素，而且棕榈仁粕中总碳水化合物的含量高达50%，其中40%左右是以难以消化的非淀粉多糖形式存在；基于此性质，本研究通过发酵技术对棕榈仁粕进行加工，研究表明发酵可将蛋白质类物质水解为小肽，更有利于家畜的消化吸收；也可将难消化的粗大纤维类物质水解为可消化的寡糖类物质，进而提高了能量利用率[1-2]。本实验对发酵棕榈仁粕超声水提及醇沉后采用福林酚法[3]，改良苯酚—硫酸法[4]对总蛋白、小肽及寡糖进行含量的测定，为判断家畜饲料能量奠定基础。

1 仪器与试剂

1.1 仪器

KQ—500E型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；UV9100B型紫外可见分光光度计(北京莱伯泰科仪器有限公司)；ST 16R高速冷冻离心机(赛默飞世尔科技(中国)有限公司)；HH—6数显恒温水浴锅(上海梅香仪器有限公司)；SHB—III循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)；FA1004N电子天平(上海精密科学仪器有限公司)；SK—1快速混匀漩涡器(中国深圳)；远红外辐射干燥箱(上海阳光实验仪器有限公司)。

1.2 试剂

牛血清蛋白(BSA，国药集团化学试剂有限公司)；碱性酮(酒石酸甲钠、硫酸铜、碳酸钠、氢氧化钠均为分析纯)；福林酚试剂(批号：HCRB110320，国药集团上海化学试剂有限公司)；无水乙醇；甘露醇。

1.3 供试品

发酵棕榈仁粕由济南现代同茂饲料有限公司提供。

2 实验方法

2.1 发酵棕榈仁粕的制备

称取适量棕榈仁粕，将芽孢杆菌、酵母菌、乳酸菌按一定比例混合制作成菌液接种在棕榈仁粕上，比例为1∶2。即50 kg原料加菌液20～25 kg，常温下密闭发酵7天即可。

2.2 发酵棕榈仁粕水提液的制备

精密称取发酵棕榈仁粕1.0000 g，按料液比1∶30加入蒸馏水，超声20min，抽滤取残渣再重复上述步骤2次。取3次上清液混合置于50mL容量瓶中用蒸馏水稀释至刻度，即得发酵棕榈水溶性提取物溶液。

2.3 50%、80%醇沉提取液的制备

分别向2.2下制备的发酵棕榈仁粕水溶性提取物溶液中加入适量无水乙醇，使其乙醇浓度为50%、80%即得50%、80%醇沉提取液。

2.4 福林酚法测定总蛋白及醇沉小肽含量

2.4.1 供试品溶液制备

分别精密量取发酵棕榈仁粕水提溶液及80%醇沉溶液2、6 mL于10 mL容量瓶中，分别加蒸馏水和80%乙醇溶液稀释至刻度，摇匀，置冰箱中备用。

2.4.2 标准牛血清蛋白液的制备

精密称取20.0000 mg牛血清蛋白置于100mL容量瓶中，加入蒸馏水稀释至刻度即得200 μg/mL的标准蛋白溶液。摇匀，置冰箱中备用。

2.4.3 标准曲线的制备

分别精密量取牛血清蛋白液0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL置于试管中，加水至1 mL，加碱性铜5 mL，摇匀，室温放置10 min，快速加入酚试剂0.5 mL，室温放置30 min，于650 nm测定其吸光度。以标准牛血清蛋白液质量为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，其回归方程为y=2.5598x+0.0103 相关系数r=0.9989。

2.4.4 供试品溶液的测定

精密量取2.4.1下的供试品溶液1 mL置于试管，加碱性铜5 mL，摇匀，按2.4.3方法测定其吸光度。发酵棕榈仁粕水提溶液及80%醇沉溶液各平行测定三次。根据回归方程计算发酵棕榈仁粕水提溶液总蛋白及80%醇沉小肽含量。

2.5 改良苯酚—硫酸法测定总糖的含量

2.5.1 供试品溶液制备

分别精密移取发酵棕榈仁粕水提液用50%、80%醇沉溶液5 mL，置于10 mL容量瓶中，分别50%、80%乙醇溶液稀释至刻度，摇匀，置冰箱中备用。

2.5.2 对照品溶液制备

准确称取干燥至恒重的甘露糖10.00 mg置于100 mL容量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度，即得0.1 mg/mL，摇匀，置冰箱中备用。

2.5.3 标准曲线制备

分别精密量取甘露糖对照品溶液0.00、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL于10 mL容量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度。再分别量取2 mL上述溶液于具塞试管中，精密加入50 g/L苯酚溶液1 mL，摇匀；迅速加入浓硫酸5 mL，摇匀；室温放置30 min后于490 nm测定吸光度。以各甘露糖的质量为横坐标，测得吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，其回归方程为y=1.4325x+0.0105，相关系数r=0.9993。

2.5.4 样品含量测定

精密量取2.5.1下供试品2 mL于具塞试管中，精密加入50 g/L苯酚溶液1 mL，摇匀；迅速加入浓硫酸5 mL，摇匀；室温放置30 min后于490 nm测定吸光度。空白对照分别取2 mL 50%、80%乙醇溶液于具塞试管中，同法测其吸光度。50%、80%醇沉溶液各平行测定三次。根据回归方程计算供试品中寡糖的含量，见表1；其RSD见表2。

表1 50%、80%醇沉发酵棕榈仁粕水提液寡糖含量对比(x±s mg/g)Table 1 sank by 50%, 80% alcohol fermentation palm kernel meal oligosaccharide content in liquid water extraction(x±s mg/g)

表2 50%、80%醇沉发酵棕榈仁粕水提液寡糖RSDTable 2 sank by 50%, 80% alcohol fermentation palm kernel meal oligosaccharide RSD in liquid water extraction

注：RSD≤5%。

3 结果与分析

此实验通过福林酚法测定每克发酵棕榈仁粕水提液中总蛋白含量为19.1579 mg，用80%乙醇沉淀后测得的小肽含量为14.5102 mg，小肽含量占总蛋白含量的75.74%，说明发酵后的棕榈仁粕蛋白质类物质多以小肽形式存在。表2中50%、80%醇沉发酵棕榈仁粕水提液寡糖RSD数值均小于5%，说明测定的数值精密度良好；由表1可以看出用50%乙醇沉淀后所测得的寡糖含量比80%醇沉的含量增大，说明用50%乙醇沉淀可以得到更多的寡糖物质。

4 讨论

(1)通过对棕榈仁粕进行发酵可以将大蛋白降解为小分子小肽类物质，将难消化的粗大纤维类物质水解为可消化的寡糖类物质，进而提高了能量利用率，作为饲料而言，可以增加其营养性，功能性和适口性，更有利于家畜的吸收和利用[5]。由实验结果看出小肽含量占到总蛋白的75.74%，由此推断发酵可使棕榈仁粕中的总蛋白部分可以转化为能够很好吸收的多肽类物质；通过醇沉可以得到较多的寡糖物质。

(2)寡糖又称低聚糖是少数单糖(2～10个)缩合的聚合物，可通过多糖水解得到。在前人总结中可看出寡糖可以促进肠道有益菌繁殖，调节菌群结构，保持肠道正常生理功能、抗氧化、提高动物体液和细胞免疫、促进消化吸收等优点[6]，本研究通过发酵及水提醇沉法得到大量的寡糖物质尤其在50%乙醇下沉淀会得到较80%乙醇沉淀更多寡糖物质，为今后对寡糖在棕榈仁粕饲料的应用奠定基础。

(3)醇沉工艺的原理是提取物既溶于水又溶于乙醇，用适量浓度乙醇沉降可有效的除去粘液质、糊化淀粉、果胶等杂质。通常当乙醇浓度为50%～60%时可除去淀粉等杂质；75%时可除去蛋白质类物质；80%时几乎可以将全部的蛋白质除去。因此本文选用80%乙醇进行降沉测定多肽含量，用50%和80%乙醇降沉进行寡糖含量的对比。

[1] 唐茂妍,陈旭东,和小明.棕榈仁粕在动物饲料中的应用研究[J].饲料工业,2013,34(20):45-48.

[2] 殷腊生,张麒麟,陈正望.固体发酵法生产棕榈仁粕多肽饲料的研制[J].饲料与畜牧,2010(7):43-46.

[3] 刘春雨,刘玉慧,李晓辉,等.蜈蚣粉发酵前后水溶性物质含量对比研究[J].湖南中医杂志,2016，32(11)：167-169.

[4] 董 群,郑丽伊,方积年.改良的苯酚硫酸法测定多糖和寡糖含量的研究[J].中国药学杂志,1996,31(9):550-553.

[5] 殷腊生,赵初辉,李 晶,等.固体发酵法生产棕榈仁粕多肽饲料的研制[J].饲料与畜牧,2009(10):26-28.

[6] 李亚学,周岩民.寡糖在饲料中的应用研究进展[J].兽药与饲料添加剂,2009,14(6):18-21.

(本文文献格式：刘春雨，刘 颖，王彦多，等.发酵棕榈仁粕活性物质含量测定[J].山东化工,2017,46(5):78-79,82.)

Determination of the Content of Active Substances in Fermented Palm Kernel Meal

LiuChunyu1,LiuYing1,WangYanduo1,CaoGuangchao1,WangJihui2*

(1. College of Pharmacy, Shandong University of Traditional Chinese Medicine,Jinan 250355,China;2. The Experiment Center of Shandong University of Traditional Chinese Medicine,Jinan 250355,China)

Determining the contents of water-soluble protein and polypeptide, and ethyl alcohol deposition in fermented palm kernel meal. Methods: By using the water to mention alcohol sink fermented palm kernel meal for the extraction of active substance respectively, using the foline-phenol method for content determination of total protein and polypeptide, using modified phenol - sulfuric acid method for content determination of sugars. Results: Through determining the fermented palm kernel meal content of active substances, it is concluded that water in the fermented palm kernel meal per gram total protein content was 19.1579 mg, sank 80% alcohol extract of the peptide content was 14.5102 mg, sank 80% alcohol extract of the content of oligosaccharides was 175.5923 mg, sank 50% alcohol extract of oligosaccharide content was 286.5267 mg. Conclusion: Foline-phenol method was used to ferment palm kernel meal water to mention 80% alcohol and total protein, polypeptide measurement to determine the specific content; For 50% respectively using modified phenol - sulfuric acid method, sank 80% alcohol extract of oligosaccharide content determination, that sank 50% alcohol extract of oligosaccharide content more than 80% alcohol sink extract content of oligosaccharid

fermented palm kernel meal;water extraction and alcohol precipitation;content determination; foline-phenol method;modified phenol sulfuric acid method

2017-02-07

山东中医药大学大学生研究训练(SRT)计划资助项目(编号：2016032)

刘春雨(1995—)，女，山东济南人，2014级制药工程专业本科生；*通信作者：王集会(1962-)，男，副教授，研究方向：虫类中药发酵及活性成分研究。

O657.3

A

1008-021X(2017)05-0078-02