新生儿筛查发现的原发性肉碱缺乏症临床与基因分析

孙 云 马定远 王彦云 程 威 梁晓威 蒋 涛

南京医科大学附属妇产医院 遗传医学中心新生儿筛查室（江苏南京 210004）

新生儿筛查发现的原发性肉碱缺乏症临床与基因分析

孙 云 马定远 王彦云 程 威 梁晓威 蒋 涛

南京医科大学附属妇产医院 遗传医学中心新生儿筛查室（江苏南京 210004）

目的探讨原发性肉碱缺乏症的临床和基因突变特点。方法 回顾分析2013年12月—2016年12月以串联质谱技术新生儿筛查发现的6例原发性肉碱缺乏症及2例母源性肉碱缺乏患儿的临床资料。结果 8例患儿血游离肉碱初筛值为（5.85±1.65）μmol/L，召回复查值（5.22±1.02）μmol/L，其中6例原发性肉碱缺乏症患儿采用基于Ion Torrent半导体测序技术的遗传代谢病Panel进行基因诊断，均检测到2个等位基因致病性突变；口服左旋肉碱治疗后血游离肉碱（20.24±3.88）μmol/L，继续随访中；另2例母源性肉碱缺乏患儿混合喂养1周后血游离肉碱基本恢复正常，未进行基因诊断。结论 采用串联质谱技术新生儿筛查及二代测序Panel可有效检出原发性肉碱缺乏症，早期规范治疗预后良好。

原发性肉碱缺乏症； 游离肉碱； SLC22A5基因

原发性肉碱缺乏症（primary carnitine deficiency，PCD）是由于细胞膜上的肉碱转运蛋白出现异常，不能将肉碱转运至细胞内，从而导致长链脂肪酸无法进入线粒体基质参与脂肪酸β氧化，为机体供能，该病是脂肪酸氧化代谢病中最常见的一种，属于常染色体隐性遗传。PCD是可治疗的遗传代谢病，随着串联质谱技术新生儿筛查在我国的推广，越来越多的PCD患儿得以早期筛查、诊断和治疗，预后改善。南京医科大学附属妇产医院2013年12月—2016年12月通过串联质谱技术新生儿筛查发现并诊断6例PCD及2例母源性肉碱缺乏，现将临床和基因分析情况报告如下。

1 临床资料

2013年12月—2016年12月南京医科大学附属妇产医院采用串联质谱技术筛查新生儿66 396例，诊断PCD 6例，其中男2例，女4例。

新生儿出后72小时采集足跟血，制成干血滤纸片，采用串联质谱技术（Waters Quattro API 串联质谱仪，试剂购自PerkinEImer）测定游离肉碱浓度，检测方法参考文献[1]。游离肉碱参考值范围：10～49.5μmol/L。初筛血游离肉碱低于10μmol/L立即召回复查，同时检测母亲血游离肉碱水平。初筛及召回复查血游离肉碱均低于10μmol/L者在父母知情同意下，采用遗传代谢病基因诊断Panel进行基因诊断（经医院伦理委员会审核）。

遗传代谢病基因诊断Panel覆盖51个病种98个基因，其中Panel1覆盖氨基酸代谢病18个病种35个基因，Panel 2覆盖有机酸代谢病和糖原代谢病17个病种42个基因，Panel 3覆盖脂肪酸代谢病16个病种21个基因。采用OMEGA 基因组DNA提取试剂盒（美国OMEGA生物技术公司）提取外周静脉血基因组DNA。文库构建采用Life technologies公司发布的Ion AmpliSeq™ Inherited Disease Panel 试剂盒及Ion AmpliSeq™ Library Kit 2.0 (catalog no.4475345)对Panel3的21个基因全外显子进行扩增。PCR扩增反应体系及条件按说明书进行。采用Ion XpressTM Barcode Adapters 1-16 Kit ( catalog no. 4471250) 对样品加上序列标签及Ion Torrent个体化基因组测序仪(personal genome machine，PGM)测序平台兼容的测序接头。乳液PCR和ISPs富集采用Ion PGM 200 Xpress Template Kit (catalog no.4474280)，操作步骤按说明书进行。Ion Torrent PGM平台测序采用Ion PGM 200 Sequencing Kit(catalog no. 4474004，Life Technologies)及Ion Torrent 316芯片在Ion Torrent PGM平台进行测序反应，共65个测序循环。结果分析采用Ion Torrent Suite v4.4软件进行Ion Torrent数据提取、序列比对及SNPs和Indels提取，得到的SNPs和indels经dbSNP 138数据库过滤后，可疑致病突变经Sanger测序法进行验证。

6例PCD患儿SLC22A5基因均找到2个已报道的致病位点突变（表1，图1），分别来自父亲和母亲；2例母源性肉碱缺乏女性患儿家属拒绝基因诊断。8例均为足月儿，无临床症状。

表1 6例PCD患儿临床及基因分析

图1 SLC22A5基因突变Sanger测序图

确诊后6例PCD患儿均以左旋肉碱100 mg/(kg·d)，分3次口服。治疗初期每两周门诊随访1次，血游离肉碱正常且稳定后每3个月门诊随访1次，治疗期间定期复查串联质谱（游离肉碱控制在20μmol/L左右，其他多种酰基肉碱均在正常范围）。随访项目：体格检查、血糖、血氨、肝功能、肌酸激酶、血红蛋白等，影像学检查包括腹部超声、超声心动图，评估生长、智力及运动发育情况。末次随访年龄为0.2～2岁，末次随访时，6例患儿生长发育均在正常范围内，仍在继续随访中。

2 讨论

1975年Karpmi 等[2]首次报道PCD，不同国家或地区的PCD患病率从1/120 000到1/40 000，人群中杂合子的发生率为0.5%～1%[2，3]。我国尚无全国性患病率的统计数据，上海统计发病率约1/45 000[4，5]，浙江省约为1/22 384[6]，本研究共筛查新生儿66 396例，诊断PCD 6例，发病率为1/11 066，与上海杭州等地相比偏高，考虑与地域差异和统计年限较短有关。

PCD的致病基因为SLC22A5，定位于染色体5q31.1，包含10个外显子和3个内含子，目前已经检测出110余种突变类型，多为错义突变，不同地区人群中的热点突变有所不同，国内大多数研究认为c,760C＞T(p,R254X)和c,1400C＞G(p,S467C)是中国大陆地区的热点突变[5]。本研究中的6例患儿均检测到2个致病性突变，其中c,760C＞T(p,R254X)和c,400C＞G(p,S467C)突变的出现频率高达50%，也证实了这一结论。

PCD的诊断主要依赖于血游离肉碱水平、临床表现和基因突变分析。本研究中的6例PCD患儿及2例母源性肉碱缺乏患儿初筛血游离肉碱均低于实验室截断值（＜10μmol/L），均值只有6.42μmol/L，证实了串联质谱技术新生儿筛查对于PCD诊断的意义，同时也能有效检出母亲PCD。由于肉碱可通过胎盘转运至胎儿体内，因此新生儿出生后短时间内的血浆游离肉碱水平往往反映的是母亲血浆游离肉碱水平，即部分新生儿患者由于母体的保护作用导致新生儿期血浆游离肉碱水平未明显低于正常，另有部分新生儿携带者由于母体(PCD患者)的影响导致其血浆游离肉碱水平低下。因此，对于可疑PCD患儿，同时检测母亲血游离肉碱水平很有必要。本研究中2例母源性肉碱缺乏者，初筛游离肉碱偏低，召回复查时同时检测母亲也偏低，经混合喂养1周后复查，新生儿游离肉碱均升高至接近正常水平，符合母源性肉碱缺乏的临床表现。详细询问病史，此2例PCD母亲均无临床症状。另外，临床有一部分患儿为继发性肉碱缺乏，如早产儿、重症营养不良、透析丢失过多以及其他有机酸或脂肪酸代谢病，仅凭串联质谱筛查游离肉碱降低以及临床特征很难明确诊断，需依赖于基因诊断[7]。

PCD可于任何年龄发病，主要表现为扩张型心肌病、肝肿大、肌无力等，若不及时治疗，可导致死亡，故早期诊断、及时治疗是改善预后的关键。PCD的治疗主要是口服或静滴左旋肉碱，静滴左旋肉碱主要适用于病情危重、无法进食的重症患儿，本研究中的6例患儿经新生儿筛查发现，无临床症状，因此均予口服左旋肉碱治疗，所有患儿末次随访时血游离肉碱及其他多种酰基肉碱浓度正常，生长发育正常。然而，临床上发现，PCD患儿绝大部分无明显临床症状，仅须口服左卡尼丁，患儿及家长的治疗依从性较差，反复中断治疗，由于中断治疗可诱发脂肪代谢紊乱甚至猝死等严重后果[8，9]，因此，详细告知病情并签署知情同意书，嘱咐规范治疗很重要。

本研究中的二代测序Panel，将串联质谱新生儿筛查的病种进行了整合，覆盖了目前所有筛查病种并加入了须鉴别诊断的多个病种，对于遗传代谢病的诊断优势明显，较之单纯采用二代测序技术检测，极大程度地缩短诊断时间，避免误诊漏诊，并且更加经济方便。早期规范左旋肉碱治疗的原发性肉碱缺乏症患儿预后良好。

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Clinical and gene analysis of primary carnitine deficiency found by neonatal screening

SUN Yun, MA Dingyuan,WANG Yanyun, CHENG Wei, LIANG Xiaowei, JIANG Tao (Center of Genetic Medicine, Obstetrics and Gynecology Hospital Affiliated to Nanjing Medical University, Nanjing 210004, Jiangsu, China)

ObjectiveTo explore the clinical feature and gene types in patients with primary carnitine deficiency.MethodsClinical data of 6 patients with primary carnitine deficiency and 2 patients with maternal carnitine deficiency found in the screening by tandem mass spectrometry technology during December 2013 to December 2016 were retrospectively analyzed.ResultsThe free carnitine levels of 8 patients in initial and recall screening were 5.85±1.65 μmol/L and 5.22±1.02 μmol/L.Two pathogenic alleles were detected in each patient with primary carnitine deficiency by genetic and metabolic disease panel based on Ion Torrent semiconductor sequencing. After treatment with oral L-carnitine, the free carnitine levels of 6 patients with primary carnitine deficiency were 20.24±3.88 μmol/L. The carnitine levels returned to normal after mixed feeding for one week in 2 patients with maternal carnitine deficiency, and no genetic diagnosis was carried out. Conclusion Primary carnitine deficiency can be effectively detected using tandem mass spectrometry technology and next generation sequencing panel and the prognosis is good with early standard treatment.

primary carnitine deficiency; free carnitine; SLC22A5 gene

2016-11-25）

（本文编辑：梁 华）

10.3969/j.issn.1000-3606.2017.09.008

国家自然科学基金（No.81541064，81671475）；南京市医学科技发展重点项目（No.ZKX14041）

蒋涛 电子信箱：jiangzhang784@163.com