猪流行性腹泻病毒与链球菌混合感染的诊断

胡兴义,张双翔,冯旭芳,丁尊俄,刘丽娟,蒲翠敏,张 海,周碧君,王开功＊

(1.贵州大学动物科学学院，贵州 贵阳 550025；2. 贵州省动物疫病研究室，贵州 贵阳 550025；3.贵州省动物疫病预防控制中心，贵州 贵阳 550001；4.贵州省德江县动物疫病预防控制中心，贵州 德江 565200）

猪流行性腹泻病毒与链球菌混合感染的诊断

胡兴义1.2,张双翔3,冯旭芳4,丁尊俄1.2,刘丽娟1.2,蒲翠敏1.2,张 海1.2,周碧君1.2,王开功1.2＊

(1.贵州大学动物科学学院，贵州 贵阳 550025；2. 贵州省动物疫病研究室，贵州 贵阳 550025；3.贵州省动物疫病预防控制中心，贵州 贵阳 550001；4.贵州省德江县动物疫病预防控制中心，贵州 德江 565200）

随着我国养殖业的规模化、集约化发展，猪病毒性腹泻已成为威胁我国养猪业发展的主要原因之一。猪病毒性腹泻的病因十分复杂，主要的病原有猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪轮状病毒(PoRV)和猪嵴病毒(PKV)。这4种病毒均能引起猪的肠道传染病，感染后主要表现为严重腹泻、呕吐、脱水和仔猪的高死亡率，各种年龄的猪均易感染，其中对哺乳仔猪的危害最为严重，发病率可达100%[1]。这4种病原所致腹泻其临床症状和病理变化极其相似。此外，当前猪腹泻也多存在细菌感染，如大肠杆菌、链球菌、沙门氏菌和猪丹毒等感染所致，且存在混合感染的情况，单从临床上鉴别诊断较难，给养殖户专业技术人员用药增加难度[2]。因此通过实验室诊断技术对猪腹泻进行病原诊断尤其重要，也为猪腹泻疫病的诊断和药物选择提供帮助。

2017年2月贵州省贵阳市某规模化养猪场发生腹泻大流行，导致其哺乳仔猪大量死亡。笔者通过对该猪场3头哺乳弱仔猪进行剖检和实验室诊断，特做如下报道。

1 材料

1.1 临床样本

来自贵州省贵阳市某种猪场3头产房哺乳弱仔猪。

1.2 主要试剂

RNA提取试剂盒购自北京世纪元亨动物防疫有限公司；反转录试剂盒和PrimeScriptTMRT Master Mix购自宝生物工程（大连）有限公司。营养肉汤培养基、营养琼脂培养基、鲜血营养琼脂培养基、麦康凯琼脂培养基，购自杭州微生物试剂有限公司；新生牛血清购自浙江天航生物科技有限公司。草酸铵结晶紫、革兰氏碘液、95%酒精、沙黄染液、生理盐水由贵州大学预防兽医学实验室自制。

2 方法

2.1 剖检病理观察

对送检的3头哺乳弱仔猪进行解剖，沿其腹白线切开，钝性剥离腹内膜，观察其免疫器官和肠道的病理情况。采集其肠道组织和粪便。

2.2 病原核酸检测

取送检猪的粪便、肠等组织，研磨，离心提取上清，采用北京世纪元亨猪流行性腹泻病毒检测试剂盒提取总RNA，针对PEDV 特异性引物(目的片段444 bp)进行RT-PCR扩增，产物通过1．2%琼脂糖凝胶电泳检测。

2.3 引物设计与合成

根据PEDV M基因保守序列设计一对特异性引物，并送上海英俊生物有限公司合成，引物序列见表1。

2.4 反应体系建立

反应体系为25µL，2×Taq PCRMasterMix 12．5 µL，上下游引物各1µL，模板RNA 2µL，灭菌ddH2O8．5µL。

表1 引物序列

反应条件：94 ℃预变性3 min；95 ℃变性30 s，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃最后延伸7 min，4 ℃保存。

PCR反应结束后， PCR产物经1．2%琼脂糖凝胶电泳检测，观察其结果。

2.5 细菌分离培养

取送检猪的肝脏、肺脏、肾脏、空肠、心脏以及脾脏等组织分别接种于鲜血琼脂培养基、麦康凯培养基、普通琼脂培养基上，37 ℃培养24 h，并挑取单个细菌进行革兰氏染色及显微镜观察。

3 结果

3.1 剖检病理变化结果

对送检的3头哺乳弱仔猪进行剖检，表现肠系膜淋巴结出血，颌下淋巴结出血等症状。主要剖检图片如图1和图2。

图1 颌下淋巴结出血

图2 肠系膜淋巴结出血

3.2 病原核酸检测结果

通过对送检的3头哺乳弱仔猪进行取材，经总RNA提取，反转录和PCR扩增，取7 µL扩增产物上样于1．2%琼脂糖凝胶电泳分析结果。结果显示，猪流行性腹泻病毒检测结果为阳性，扩增条带与预期结果一致，表明送检3头哺乳弱仔猪为PEDV感染所引起，见图3。

表2 分离细菌药敏试验结果

图3 检测结果

3.3 细菌分离培养结果

取送检的3头哺乳弱仔猪的肝脏、肺脏、肾脏、空肠、心脏以及脾脏等组织分别接种于鲜血琼脂培养基、麦康凯培养基、普通琼脂培养基上，37 ℃培养24 h，可见多种脏器分离到细菌（见图4）。经革兰氏染色镜检，肝脏和心脏部位接种所生长的细菌为革兰氏阳性球菌，生化鉴定初步确定为链球菌(见图5)。

图4 取组织做细菌培养

图5 挑取细菌制片进行显微镜观察

3.4 细菌药敏试验结果

图6 细菌的药敏试验

挑取纯化细菌做药物敏感试验，37 ℃培养12～16 h，结果见图6和表2。由表2结果可见，分离到的细菌对多种药物均不敏感，可用肠道康等相似药物进行防控。

4 小结

通过对送检的3头哺乳弱仔猪样本进行猪流行性腹泻病毒病原核酸检测，结果显示，送检样本中均存在猪流行性腹泻病毒感染，建议加强免疫。尤其是哺乳仔猪阶段，临床上建议采用跟胎免疫方法，使哺乳仔猪获得保护性抗体。经细菌培养显示，该猪场存在链球菌感染，在寒冷季节应加强哺乳仔猪饲养管理，强化猪舍环境卫生管理，提高圈舍内的温度，及时补糖补液、适时止泻、按时驱虫及免疫，定期消毒，消毒药物的种类交替使用。

[1] SUN RUI QIN， CAIRU JIAN， CHEN YA QIANG， et al． Outbreak ofporcine epidemi c diarrhea in sucking piglets， China [J]． Em erg Infect Dis， 2012， 18(1)： 161-163．

[2] 胡兴义，张双翔，金志强，等． 贵州地区仔猪病毒性腹泻流行病学调查[J]．中国预防兽医学报，2016，38(7)：542-545．

2017-04-02)

“贵州省仔猪腹泻性疫病风险分析及综合防控技术研究”(黔科合NY[2015]3009-1号)；“贵州大学研究生创新基金项目”(研农2017007）；“贵州省动物疫病防控与兽医公共卫生保障科技创新人才团队”(黔科合人才团队[2015] 4016号)。

胡兴义（1990-），男，贵州织金人，在读硕士，主要从事预防兽医学，E-mail：997263065@qq.com。

* 通信作者:王开功，教授，硕士生导师，E-mail:kaigongwang@aliyun.com