去甲斑蝥素纳米胶束的制备及抑瘤作用研究

王 琳，陆丹玉，方 晨(.苏州卫生职业技术学院药学院，江苏苏州 25009;2.苏州大学医学部药学院，江苏苏州 252;.香港浸会大学中医药学院，中国香港)

去甲斑蝥素纳米胶束的制备及抑瘤作用研究

王 琳1，2＊，陆丹玉1，方 晨3(1.苏州卫生职业技术学院药学院，江苏苏州 215009;2.苏州大学医学部药学院，江苏苏州 215213;3.香港浸会大学中医药学院，中国香港)

目的:制备去甲斑蝥素纳米胶束，并研究其抑瘤作用。方法:采用三嵌段共聚物二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺在水中自组装形成去甲斑蝥素纳米胶束。观察所制纳米胶束形态，考察其载药率、包封率、粒径和Zeta电位。通过MTT法考察阴性对照组(磷酸盐缓冲液)、载体组(空白纳米胶束)、阳性对照组(去甲斑蝥素原料药，5～320μg/m L)和去甲斑蝥素纳米胶束组(以去甲斑蝥素计，5～320μg/m L)人肺癌A549细胞在作用不同时间(24、48、72 h)后的细胞生存率。将荷瘤裸鼠随机分为空白对照组、去甲斑蝥素注射液组(1mg/kg)和去甲斑蝥素纳米胶束低、高剂量组(0.5、1mg/kg)，每组6只，每天尾iv相应药物1次，连续8周;每周测量肿瘤的大小，给药结束后第2天检测瘤质量。结果:去甲斑蝥素纳米胶束呈圆球状，载药率为(2.82±0.05)%，包封率为(83.67±1.78)%，粒径为(138.6±45.8)nm，Zeta电位为-(12.75±0.34)mV(n=6);载体组A549细胞生存率无明显变化，阳性对照组和去甲斑蝥素纳米胶束组A549细胞生存率明显降低，与浓度和时间呈正相关，且去甲斑蝥素纳米胶束组细胞生存率降低程度较阳性对照组更明显(P＜0.01)。与空白对照组比较，3个给药组裸鼠的瘤质量均减小(P＜0.05)，其中去甲斑蝥素纳米胶束高剂量组减小程度较去甲斑蝥素注射液组更明显(P＜0.05)。结论:成功制得去甲斑蝥素纳米胶束，其对A549细胞具有较好的体内外抑瘤作用。

二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺;去甲斑蝥素;纳米胶束;抑瘤作用

去甲斑螯素(Norcantharidin)是将斑螯属昆虫南方大斑螯和黄黑小斑螯的虫体所含的抗癌有效成分斑螯素(Cantharidin)1，2位去甲基而得的，是我国首先研制开发的具有一定潜力的抗肿瘤药物[1-2]。但由于其毒性很大，在人工胃液及人工肠液中以去甲斑螯酸的形式存在[3-4]，水溶性增加，导致其口服生物利用度低，影响了其对肿瘤细胞的抑制和杀伤作用，限制了其临床应用。本研究拟采用三嵌段共聚物二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺(DSPE-PEG-MAL)制备在水中自组装形成PEG在外、其他成分及药物在内的去甲斑螯素纳米胶束，并研究其抑瘤作用。

1 材料

1.1 仪器

Acquity超高效液相色谱仪(UPLC)，包括PDA Detector光电二极管阵列检测器(美国Waters公司);激光散射粒径测定仪(美国Beckman Coulter有限公司); 5417R冷冻台式离心机(德国Eppendorf公司);倒置显微镜(德国Leica公司);IVIS Lum ina XR活体动物体内成像系统(美国Caliper生命科学公司);HT7700透射电镜(日本Hitachi公司);连续光谱酶标仪(美国Bio-Rad公司)。

1.2 药品与试剂

去甲斑螯素原料药(南京泽朗医药科技有限公司，批号:20141206，纯度:＞98%);去甲斑螯素对照品(中国食品药品检定研究院，批号:100414-201501，纯度: 100%);DSPE-PEG2000-MAL(美国Avanti公司，批号: 228234);大豆卵磷脂(美国AvantiPolar Lipids公司，批号:186969);胆固醇(美国Sigma公司，批号:C8667-25G，纯度:94%);交联葡聚糖G50(美国Pharmacia公司进口分装，上海化学试剂厂，粒径:100～300μm);胎牛血清、DMEM培养基、胰蛋白酶(美国Gibco公司);MTT (德国Merck公司，批号:475989);正辛醇、甲醇、无水乙醇等均为分析纯，乙腈为色谱纯。

1.3 细胞与动物

人肺癌细胞株A549和A549荧光酶素细胞株A 549-luc均购自上海睿星生物技术有限公司。BALA/C裸鼠36只，SPF级，♂，4～6周龄，体质量在19 g左右，购自香港中文大学实验动物中心，动物编号为2015-0241。

2 方法

2.1 去甲斑蝥素纳米胶束的制备

将一定比例的去甲斑螯素和DSPE-PEG2000-MAL，用一定量的乙醇超声溶解后，以1滴/10 s的速度逐滴加入至磁力搅拌的蒸馏水中，挥发30m in，倒入透析袋中，封口，在1 000m L的蒸馏水中透析24 h，每4 h换1次水。最后将制得的聚合物纳米胶束溶液4 000 r/min(离心半径13.5 cm，下同)离心30min，取上清，即得去甲斑螯素纳米胶束。其中，离心的目的是为了除去沉降在离心管底部的未包载的聚合物。同法制得不加去甲斑螯素的空白纳米胶束。

2.2 去甲斑蝥素的含量测定

2.2.1 色谱条件色谱柱:BEH Shield RP-18(50mm× 2.1mm，1.7μm);流动相:0.02mol/L磷酸二氢钾溶液(用磷酸调节pH至3.0)-甲醇(75∶35);检测波长:213 nm;流速:0.6m L/m in;柱温:35℃;进样量:5μL。

2.2.2 方法学考察 精密称取去甲斑螯素对照品适量，加磷酸盐缓冲液(PBS)溶解制成一定浓度的对照品溶液，取对照品溶液和阴性对照溶液(PBS)进样分析。另取经交联葡聚糖G50分离后的去甲斑螯素纳米胶束溶液和空白纳米胶束溶液，加消解液超声消解，定容，12 000 r/m in离心5m in，取上清液进样分析，记录色谱。另按方法学相关要求操作，考察去甲斑螯素的回归方程、线性范围、回收率、稳定性、精密度。

2.3 纳米胶束的质量评价

2.3.1 载药量与包封率 取去甲斑螯素纳米胶束溶液适量，按“2.2.1”项下色谱条件进样测定其中去甲斑螯素的含量，根据2015年版《中国药典》(四部)中的相关规定[5]，计算载药量和包封率。载药量(%)=纳米胶束中去甲斑螯素质量/纳米胶束的质量×100%;包封率(%)=纳米胶束中去甲斑螯素质量/去甲斑螯素的投药量× 100%。

2.3.2 粒径、Zeta电位与形态 取100μL的去甲斑螯素纳米胶束溶液，用PBS稀释至2m L，混匀，采用激光散射粒径测定仪分析其粒径和Zeta电位。采用磷钨酸钠溶液对纳米胶束进行染色，透射电镜下观察其形态。

2.3.3 体外释放度 取1份去甲斑螯素原料药和3份相同质量的去甲斑螯素纳米胶束，分别用蒸馏水定容至5 m L，置于透析袋中密封。将原料药溶液置于装有10m L含1%十二烷基硫酸钠(SDS)的PBS(pH为7.4)的离心管中，将胶束溶液分别置于装有10m L PBS(pH分别为6.5、7.0、7.4)的离心管中，(37±0.5)℃下以100 r/m in恒温振荡。分别于0、0.5、l、2、4、6、8、12、24、36、48、60、72 h取样，每次将10m L释放液全部倒出，同时补充10m L新鲜释放介质。释放液按“2.2.1”项下色谱条件进样测定去甲斑螯素含量，计算累积释放度(Q)，以取样时间(t)为横坐标、Q为纵坐标绘制标准曲线。

2.4 体外抗肿瘤活性实验

2.4.1 细胞培养 采用含10%胎牛血清的DMEM培养基，于37℃、5%CO2培养箱中培养A549细胞，待细胞生长达90%融合状态时以0.25%胰蛋白酶消化，根据试验需要接种于96孔板上。

2.4.2 细胞生存率测定 将A549细胞复苏传代，待生长状态良好时，用胰酶消化，用含10%胎牛血清的DMEM培养液调整细胞密度为5×104m L-1，以每孔100 μL接种于96孔板中，在37℃、5%CO2培养箱中培养24 h后开始加药。试验分为4组，分别为(1)阴性对照组:只加PBS，不加药物;(2)载体组:加空白纳米胶束溶液; (3)阳性对照组:加质量浓度分别为5、10、20、40、80、160、320μg/m L的去甲斑螯素原料药溶液(原料药先溶解在二甲基亚砜中，再用PBS稀释至所需质量浓度); (4)去甲斑螯素纳米胶束组:加去甲斑螯素质量浓度分别为5、10、20、40、80、160、320μg/m L的去甲斑螯素纳米胶束溶液(纳米胶束用PBS稀释至所需质量浓度)，每个质量浓度设3个复孔。加药后继续培养24、48、72 h，每孔再加入5mg/m L的MTT 20μL，培养4 h，取出，弃上清，加入二甲基亚砜150μL，振荡15m in均匀溶解，在570 nm波长处测定OD值，计算细胞生存率。细胞生存率(%)=加药组OD值/阴性对照组OD值×100%。分别对影响细胞生存率的药物质量浓度作析因分析和单向方差分析，对药物作用时间作重复测量的方差分析。

2.5 体内抗肿瘤活性实验

2.5.1 荷瘤裸鼠模型建立 将A549-luc细胞复苏，用含10%胎牛血清的DMEM培养液于37℃、5%CO2的培养箱中培养。待细胞生长至80%瓶底面积时，用0.25%胰蛋白酶消化，收集细胞于离心管内，1 000 r/m in离心5 min，弃上清，用PBS冲洗3次，用不含血清的DMEM培养液重悬细胞后调整细胞密度为5×106m L-1。将细胞悬液用注射器接种于裸鼠腋下，每只0.2m L。每次注射前将细胞摇匀，以保证肿瘤成瘤比较均匀;接种完成后用手指轻压注射点，防止细胞外渗。所有细胞保证在2 h内接种完毕，所有操作均在无菌操作台内进行。7 d后，所有裸鼠均成为荷瘤裸鼠。

2.5.2 体内抑瘤实验 将荷瘤裸鼠随机分成空白对照组(生理盐水)、去甲斑螯素注射液组(1mg/kg)和去甲斑螯素纳米胶束低、高剂量组(0.5、1mg/kg)，每组6只。给药剂量是根据笔者前期的急性毒性实验结果(裸鼠对于去甲斑螯素的最大耐受量为1mg/kg)设置的。接种成功后的第2天开始每天尾iv相应药物1次，连续8周。从给药的第1天起，每天观察裸鼠的饮食、精神状态，测量肿瘤长径(a)和短径(b)，按公式V=ab2/2估算肿瘤的近似体积(V，cm3)，绘制肿瘤生长曲线。给药结束后的第2天，将荷瘤裸鼠处死，剥瘤，称质量，计算抑瘤率，抑瘤率(%)=(对照组瘤质量-给药组瘤质量)/对照组瘤质量×100%。采用SPSS 19.0软件对数据结果进行单因素方差分析。P＜0.05表示差异有统计学意义。

3 结果

3.1 去甲斑蝥素的含量测定方法学考察结果

系统适用性结果显示，去甲斑螯素的保留时间在6.2m in左右，阴性对照溶液及空白纳米胶束溶液对其测定均无干扰。去甲斑螯素峰面积(y)对质量浓度(x)的回归方程为y=61.534x+169.99(r2=0.999 9，n=6)，线性范围为25.41～813.12μg/m L;加样回收率为(99.58± 1.95)%(n=6);10 h内稳定性试验中含量的RSD为1.11%(n=6);去甲斑螯素低、中、高浓度的精密度试验中峰面积的RSD分别为2.07%、1.31%、0.83%(n=6)，色谱图见图1。

3.2 纳米胶束质量评价

去甲斑螯素纳米胶束呈圆球状、边缘整齐、表面光滑，载药量为(2.82±0.05)%，包封率为(83.67±1.78)%，粒径为(138.6±45.8)nm，Zeta电位为-(12.75±0.34) mV(n=6)，透射电镜图见图2。

3.3 体外释放度

去甲斑螯素原料药具有突释效应，在2 h内Q已达80%，6 h内Q已达95%;去甲斑螯素纳米胶束在不同pH释放介质中均随着时间延长缓慢持续释放，释放曲线呈抛物线形。pH为6.5、7.0时去甲斑螯素纳米胶束呈现出比pH为7.4时更快的释放速度。72 h时，去甲斑螯素纳米胶束在pH 6.5、7.0、7.4释放介质中的Q分别为(83.5±3.5)%、(80.0±1.6)%、(72.0±1.5)%(n=6)。累积释放曲线见图3。

图1 超高效液相色谱图Fig 1 UPLC chromatogram s

图2 去甲斑蝥素纳米胶束的透射电镜图(×12 000)Fig 2 Transm ission electron m icroscopy figure of NCTD nano-m icelle(×12 000)

图3 累积释放曲线Fig 3 Cum ulative release curves

3.4 体外抗肿瘤活性

结果显示，载体组A549细胞生存率无明显变化，阳性对照组和去甲斑螯素纳米胶束组A549细胞生存率明显降低，且与药物浓度和作用时间呈正相关。其中，去甲斑螯素纳米胶束组细胞生存率降低程度强于阳性对照组(P＜0.01)。各组A549细胞的细胞生存率测定结果见图4。

图4 各组A549细胞在不同作用时间后细胞生存率的测定结果(n=3)Fig 4 Determ ination results of the survival rates of A549 cells after acting for different tim e in each group(n=3)

3.5 体内抗肿瘤活性

实验期间裸鼠一般情况良好，未见死亡。处死后解剖各器官均未见瘤转移。各组荷瘤裸鼠移植瘤生长曲线见图5，切除后各组裸鼠的肿瘤形状见图6。

图5 各组荷瘤裸鼠移植瘤生长曲线Fig 5 Grow th curves of transplanted tumor of tumor nudem ice in each group

图6 各组荷瘤裸鼠移植瘤的图片Fig 6 Pictures of transp lanted tum or of tum or nude m ice in each group

由图5所示，在给药的前3周，空白对照组和所有给药组裸鼠的肿瘤大小没有显著变化。从给药第3周开始到第8周，空白对照组荷瘤裸鼠的瘤体积呈持续快速增长的趋势;到第8周，空白对照组荷瘤裸鼠的呼吸非常困难。与空白对照组比较，去甲斑螯素注射液组和去甲斑螯素纳米胶束低、高剂量组荷瘤裸鼠的瘤体积均减小(P＜0.05)，其中去甲斑螯素纳米胶束高剂量组抑瘤率明显高于去甲斑螯素注射液组(P＜0.05)。各组荷瘤裸鼠的体质量、瘤质量和抑瘤率的测定结果见表1。

表1 各组荷瘤裸鼠的体质量、瘤质量和抑瘤率的测定结果(±s，n=6)Tab 1 Determ ination results of body mass，tumor quality，tumor inhibition rate of tumor nude m ice in each grou(p±s，n=6)

表1 各组荷瘤裸鼠的体质量、瘤质量和抑瘤率的测定结果(±s，n=6)Tab 1 Determ ination results of body mass，tumor quality，tumor inhibition rate of tumor nude m ice in each grou(p±s，n=6)

注:与空白对照组比较，＊P＜0.05;与去甲斑螯素注射液组比较，#P＜0.05Note:vs.blank control group，＊P＜0.05;vs.NCTD injection group，#P＜0.05

组别空白对照组去甲斑螯素注射液组去甲斑螯素纳米胶束低剂量组去甲斑螯素纳米胶束高剂量组54.78 45.22 64.35#给药前体质量，g 18.3±0.8 18.6±1.0 19.1±0.6 19.2±0.4处死时体质量，g 30.2±1.4 28.9±2.1 28.1±1.6 26.6±1.5瘤质量，g 1.15±0.14 0.52±0.12＊0.63±0.14＊0.41±0.21＊#抑瘤率，%

4 讨论

去甲斑螯素的传统剂型为片剂，尽管片剂在制备工艺上容易操作、成本低，但是不能解决去甲斑螯素生物利用度低、毒性强的缺点。国内研究学者为了解决去甲斑螯素存在的不足，将其制成了壳聚糖纳米粒、脂质体等新剂型，但是目前国内将去甲斑螯素制成聚合物胶束的研究并不多。将去甲斑螯素制成纳米胶束不仅可以具备纳米制剂的靶向性，同时还能增加药物的溶解性。载体材料DSPE-PEG-MAL的应用也是一个创新，其无毒性、无免疫原性、无抗原性以及可降解性和生物相容性的优点使其在生物医学材料界备受青睐[6-8]。

本课题初步完成了去甲斑螯素纳米胶束的制备、质量评价、体外抗肿瘤及体内抗肿瘤研究，表明其具有较好的体内外抑瘤作用。但是由于研究水平、实验条件及实验时间的限制，许多工作仍需要进一步完善。今后还将开展其药动学研究，考察去甲斑螯素纳米胶束在动物体内的组织分布，进一步验证其对肿瘤组织的靶向性。

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[4]Wu H，Fan F，Liu Z，etal.Norcantharidin combined w ith EGFR-TKIs overcomes HGF-induced resistance to EGFR-TKIs in EGFR mutant lung cancer cells via inhibition of Met/PI3k/Akt pathway[J].Cancer Chemother Pharmacol，2015，76(2):307-315.

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Preparation of Norcantharidin Nano-m icelle and Study on Its Antitumor Effect

WANG Lin1，2，LU Danyu1，FANG Chen3(1.School of Pharmacy，Suzhou Vocational Health College，Jiangsu Suzhou 215009，China;2.School of Pharmacy，Medical College of Soochow University，Jiangsu Suzhou 215213，China;3.School of Chinese Medicine，HongKong Baptist University，HongKong，China)

OBJECTIVE:To prepare the norcantharidin(NCTD)nano-micelle and study its antitumor effect.METHODS: NCTD nano-micelle was self-formed in water using Triblock copolymers distearyl phosphatidylethanolamine-polyethylene glycol-maleimide;its shape was observed，the drug-loading rate，entrapment efficiency，particle size，Zeta potential were investigated.MTT was used to investigate the cell survival rate of human lung cancer A549 cells in negative control group(Phosphate buffer solution)，carrier group(blank nano-m icelle)，positive control group(NCTD APIs，5-320μg/m L)and NCTD nano-m icelle group (NCTD，5-320μg/m L)after acting different time(24，48，72 h).Tumor nude mice were random ly divided into blank control group，NCTD injection group(1 mg/kg)，NCTD low-dose，high-dose groups(0.5，1mg/kg)，6 in each group.Allmice were intravenously injected relevantmedicines in tail，once a day，for 8 weeks.Tumor size wasmeasured every week，and tumor quality was detected after the second day of finishing adm inistration.RESULTS:NCTD nano-m icelle was round，drug-loading rate was (2.82±0.05)%，entrapment efficiency was(83.67±1.78)%，particle size was(138.6±45.8)nm，Zeta potential was-(12.75± 0.34)mV(n=6).Cell survival rate of A549 cells in carrier group had no obvious changes，and was obviously decreased in positive control group and NCTD nano-micelle group，which was positively correlated w ith concentration and time.And the decrease degree of cell survival rate in NCTD nano-m icelle group was stronger than positive control group(P＜0.01).Compared w ith blank control group，the tumor quality of m ice in 3 adm inistration groups was reduced(P＜0.05)，the reduction degree in NCTD nano-micelle high-dose group was stronger than NCTD nano-micelle injection group(P＜0.05).CONCLUSIONS:NCTD nano-m icelle is successfully prepared，which has good in vitro and in vitro anti-tumor effect on A549 cells.

Distearyl phosphatidylethanolamine-polyethylene glycol-maleimide;Norcantharidin;Nano-micelle;Antitumor effect

R943;R361+.3

A

1001-0408(2017)19-2680-05

2016-10-27

2016-12-17)

(编辑:邹丽娟)

江苏省卫生厅科技项目(No.JZ201402)

＊副教授，博士研究生。研究方向:药物新制剂。电话:0512-62693011。E-mail:wanglinlinda@126.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2017.19.25