NF-κB抑制剂PDTC对人骨髓瘤U266细胞增殖和凋亡的影响*

易 蓓， 袁海汀， 许永会， 罗 綦， 曾沉思， 陈建斌

(重庆医科大学附属第一医院血液科，重庆 400016)

NF-κB抑制剂PDTC对人骨髓瘤U266细胞增殖和凋亡的影响*

易 蓓， 袁海汀， 许永会， 罗 綦， 曾沉思， 陈建斌△

(重庆医科大学附属第一医院血液科，重庆 400016)

目的： 探讨NF-κB特异性抑制剂PDTC对多发性骨髓瘤U266细胞增殖和凋亡的影响及可能的作用机制。方法: 采用不同浓度PDTC (25、50、100和200 μmol/L)处理U266细胞，CCK-8法和活细胞计数检测U266细胞的增殖活性；流式细胞术检测细胞凋亡率及细胞周期；RT-qPCR及Western blot检测PDTC处理前后DNA甲基转移酶1(DNMT1) mRNA和蛋白的表达；Western blot检测NF-κB (P65)、DNMT1、Bcl-2、cyclin D1、cleaved caspase-3和cleaved caspase-8的蛋白水平。结果: PDTC处理U266细胞48 h后，NF-κB (P65)的蛋白水平被抑制；PDTC抑制U266细胞增殖，作用呈浓度及时间依赖性；PDTC作用48 h后，与对照组比较，细胞凋亡率呈浓度依赖性增高(P<0.05)，细胞被阻滞在G2期；DNMT1的mRNA及蛋白水平均降低；Western blot结果显示PDTC可通过抑制NF-κB下调Bcl-2的表达，使cyclin D1、cleaved caspase-3和cleaved caspase-8蛋白水平增加。结论: PDTC抑制NF-κB信号通路，通过诱导U266细胞凋亡从而抑制细胞增殖，其机制可能与抑制DNMT1的表达、阻滞细胞周期和启动凋亡途径有关。

NF-κB； PDTC； 多发性骨髓瘤； 细胞凋亡； DNA甲基转移酶1

多发性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)是浆细胞异常增殖的恶性肿瘤，约占血液系统恶性肿瘤的13%，全世界每年大约86 000的新增病例[1]。近年由于新型药物的应用及造血干细胞移植技术的发展使得该病得到极大缓解，但复发和耐药问题仍未得到有效解决[2]，积极寻求新的药物及治疗手段仍是一项重大课题。

NF-κB是一类重要的核转录因子，可以调控多种基因从而发挥多种生物学功能，包括调节细胞凋亡、参与炎症反应过程、调控细胞周期、参与肿瘤的发生及耐药等[3]。研究显示，NF-κB与血液系统肿瘤密切相关，在髄系白血病、淋巴细胞白血病、淋巴瘤和多发性骨髓瘤中均有高活性[4-7]。吡咯烷二硫代氨基甲酸盐(pyrrolidine dithiocarbamate，PDTC)是一种金属螯合物，分子量为164.29 kD，具有抗氧化作用，是NF-κB信号通路特异性抑制剂。本研究采用PDTC抑制NF-κB，观察其对MM U266细胞增殖和凋亡的影响，探究PDTC对U266细胞增殖的抑制作用及可能的相关机制，为临床应用提供理论依据。

材 料 和 方 法

1 主要试剂和仪器

人骨髓瘤U266细胞由第二军医大学长征医院侯建教授惠赠。将PDTC(Sigma)用PBS配成10 mmol/L的储存液，使用前稀释成不同浓度的工作液；RPMI-1640和二甲基亚砜(Sigma)；胎牛血清(Gibco)；细胞周期和凋亡检测试剂盒(凯基生物)；CCK-8试剂盒、蛋白提取试剂盒和BCA测蛋白浓度试剂盒(碧云天生物科技有限公司)；引物合成、Trizol reagent和逆转录及PCR试剂盒(TaKaRa)；抗β-actin抗体和抗DNA甲基转移酶1(DNA methyltransferase 1，DNMT1)抗体(Santa Cruz)；抗Bcl-2和cyclin D1抗体(Abcam)；抗cleaved caspase-3和cleaved caspase-8抗体(上海生工)。

2 主要方法

2.1 细胞培养 U266细胞于含10%胎牛血清、1%青-链霉素的RPMI-1640培养基中，37 ℃、5% CO2、饱和湿度条件下传代培养，每1～2 d换液，2～4 d传代。取对数生长期细胞进行相关实验。

2.2 CCK-8法及活细胞计数检测PDTC对U266细胞增殖的抑制作用 取对数生长期的U266细胞接种于96孔板中，每孔5×103个，每孔总体积100 μL。分别加入10 μL不同浓度的PDTC，使终浓度分别为0、25、50、100和200 μmol/L，各组设5个复孔，培养24、48和72 h后，向每孔中避光加入10 μL CCK-8试剂，继续培养2～4 h，在酶标仪450 nm波长测其吸光度(A)值，细胞生长抑制率(inhibitory rate, IR)按如下公式计算。IR (%)=[1-(A实验组-A空白对照组)/(A阴性对照组-A空白对照组)]×100%。另取U266细胞接种于6孔板中，每孔2×105个，每孔总体积4 mL，分别加入等体积不同浓度的PDTC，终浓度同上所述，培养24、48和72 h后，取适量细胞悬液与0.2%台盼蓝混合染色至计数板上计数。

2.3 流式细胞术检测U266细胞凋亡和细胞周期的变化 取对数生长期的U266细胞，调整细胞密度为2×108/L，将其接种于6孔板中，每孔总体积4 mL，往各孔中分别加入等体积不同浓度的PDTC，使终浓度为0、25、50、100和200 μmol/L，置于37 ℃、5% CO2、饱和湿度条件下培养48 h，收集各组细胞，1 000 r/min离心5 min，去上清液，用PBS洗涤2次，将细胞重悬于500 μL PBS中，送重庆医科大学生命科学院流式细胞检测中心按Annexin V-FITC/PI 试剂盒说明进行细胞凋亡检测。同样的方法收集细胞，用70%冰乙醇4 ℃固定过夜，送流式细胞检测中心进行细胞周期检测。

2.4 RT-qPCR法检测目的基因的表达 β-actin的上游引物序列为5′-CCACGAAACTACCTTCAACTCC-3′，下游引物序列为5′-GTGATCTCCTTCTGCATCCTGT-3′，产物长度132 bp； DNMT1的上游引物序列为5′-AGACTACGCGAGATTCGAGTC-3′，下游引物序列为5′-TTGGTGGCGTAGTAGTAGAGG-3′，产物长度171 bp。总mRNA的提取按照氯仿-异丙醇法进行。经紫外光分光光度计检测其浓度和纯度，按逆转录试剂盒说明(TaKaRa)总体系20 μL逆转录，得到各组cDNA。PCR反应条件：95 ℃ 30 s； 95 ℃ 5 s， 60 ℃ 30 s，共进行40个循环。每个样本设置3个复孔，实验重复3次。

2.5 Western blot法检测NF-κB (P65)、Bcl-2、cyclin D1、cleaved caspase-3、cleaved caspase-8和DNMT1的蛋白水平 同样的方法收集PDTC处理后的细胞，用核蛋白和总蛋白抽提试剂盒说明书，取上清液按BCA法测蛋白浓度说明书检测蛋白浓度。沸水浴5 min使蛋白变性。每组按照30 μg 蛋白量进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，再转至PVDF膜上，5%的脱脂奶粉封闭2 h，加入相应 I 抗4 ℃孵育过夜。TBST洗膜10 min、3次，加入相应 II 抗(1∶2 000)在37 ℃孵育1 h，接着用TBST洗膜10 min、3次。PVDF膜化学发光检测，用FUSION凝胶成像分析软件分析条带。

3 统计学处理

所有实验至少重复3次，结果采用SPSS 19.0软件进行分析，数据以均数±标准差(mean±SD)表示。多组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，组间两两比较时采用Turkey 法，以P<0.05表示差异有统计学意义。

结 果

1 PDTC抑制NF-κB (P65)结果检测

如图1所示，50和100 μmol/L的PDTC作用于U266细胞48 h后，Western blot检测细胞核中NF-κB(P65)蛋白水平与对照组相比明显降低(P<0.01)。

2 PDTC对U266细胞增殖的影响

用终浓度为0、25、50、100和200 μmol/L的PDTC分别作用于U266细胞，培养24、48和72 h后加入CCK-8试剂，酶标仪测吸光度值，结果表明：PDTC作用48 h和72 h的2个时间组中，在25～200 μmol/L的浓度梯度范围内，随着PDTC浓度的增加，生长抑制率明显升高(P<0.01)；作用24 h组，未能显示浓度递增与效应的相关性，见图2A。同时，细胞计数结果显示，不同浓度PDTC作用24 h，细胞数无明显减少；随着作用时间延长至48 h或72 h，细胞数量随PDTC浓度的增加逐渐减少，与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.01)，见图2B。两者表明，PDTC抑制U266细胞增殖，作用呈浓度及时间依赖性。

Figure 1.The protein level of NF-κB (P65) in the U266 cells treated with PDTC detected by Western blot. Mean±SD.n=3.**P<0.01vs0 μmol/L group.

图1 Western blot 检测PDTC作用于U266细胞后NF-κB(P65)的蛋白水平

Figure 2.The effect of PDTC on the proliferation of U266 cells. A: CCK-8 assay; B: cell counting. Mean±SD.n=3.**P<0.01vs25 μmol/L group;##P<0.01vs0 μmol/L group.

图2 PDTC对U266细胞的增殖抑制的检测结果

3 PDTC对U266细胞周期和凋亡的影响

采用不同浓度PDTC作用于U266细胞48 h，流式细胞术检测细胞周期和凋亡。结果显示与对照组相比，G2期的细胞所占比例相对增多(P<0.01)，但大多数细胞处在S期，见图3、表1。总的凋亡率随PDTC浓度的增加而上升，当浓度达100 μmol/L后，细胞凋亡率近最大值，PDTC组均较对照组有统计学意义(P<0.01)，见图4。

4 PDTC对U266细胞Bcl-2、cyclin D1、cleaved caspase-3和cleaved caspase-8蛋白水平的影响

PDTC处理U266细胞后，收集各组细胞提取蛋白，Western blot实验结果显示，与对照组比较，Bcl-2的蛋白水平明显下降，其蛋白水平受抑制程度与PDTC浓度呈正相关，差异有统计学意义(P<0.01)。Cyclin D1、cleaved caspase-3和cleaved caspase-8的蛋白水平随着PDTC浓度的增加而升高，在浓度为200 μmol/L时差异更加明显(P<0.05)，见图5。

5 PDTC对U266细胞DNMT1的mRNA和蛋白水平的影响

不同浓度的PDTC处理U266细胞48 h后，RT-qPCR测定DNMT1的mRNA表达，结果显示与对照组相比，PDTC组DNMT1的mRNA表达降低(P<0.01)。Western blot实验结果显示，PDTC处理后DNMT1蛋白水平明显下降，与对照组相比，差异有统计学意义(P<0.01)。且随着PDTC浓度的增加，DNMT1蛋白水平呈逐渐降低趋势，在100 μmol/L时差异较显著(P<0.01)，见图6。

Figure 3.Influence of PDTC on the cell cycle of U266 cells.

图3 流式细胞术检测PDTC对U266细胞周期的影响

表1 流式细胞术检测不同浓度PDTC对U266细胞周期的影响

**P<0.01vs0 μmol/L group.

Figure 4.The apoptotic rate of U266 cells increased with the increasing concentrations of PDTC for 48 h. Mean±SD.n=3.**P<0.01vs0 μmol/L group.

图4 流式细胞术检测PDTC作用于U266细胞48 h的细胞凋亡率

Figure 5.The protein levels of cyclinD1, cleaved caspase-3 and cleaved caspase-8 in PDTC groups were higher than those in control group but Bcl-2 decreased. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 μmol/L group.

图5 Western blot 检测不同浓度PDTC对U266细胞cyclin D1、cleaved caspase-3、cleaved caspase-8和Bcl-2的蛋白水平

Figure 6.The effect of PDTC on the expression of DNMT1 at mRNA (A) and protein (B) levels determined by RT-qPCR and Wes-tern blot, respectively. Mean±SD.n=3.**P<0.01vs0 μmol/L group.

图6 Western blot和RT-qPCR检测PDTC作用于U266细胞后DNMT1的mRNA和蛋白表达情况

讨 论

多发性骨髓瘤是浆细胞异常增殖的一种血液系统恶性肿瘤，主要累及老年人。目前，由于新型药物如沙利度胺、硼替佐米和来那度胺的应用，极大改善了病人的总体生存率，但复发和死亡率仍很高，该病仍是不可治愈的血液肿瘤[8]。因此，如何积极有效地抑制骨髓瘤细胞的增殖，探寻更加有效的药物和治疗手段是目前骨髓瘤治疗的关键。

NF-κB 是重要的转录因子家族的成员，由P50、P52、c-Rel、P65/RelA和RelB组成。NF-κB信号通路参与调节多种肿瘤的病理过程，与血液肿瘤的发生、增殖、凋亡密切相关。研究表明，在部分情况下NF-κB有促进细胞凋亡的作用，但大多数情况下可诱导多种肿瘤细胞的增殖，发挥抗凋亡的作用[9]。抑制NF-κB的活性可以增加肿瘤细胞的凋亡。文献报道，在MM中，NF-κB持续激活参与了MM的发生发展[10]。但在MM中，NF-κB高活性的具体原因我们不得而知。PDTC是氨基甲酸盐的一种，属于抗氧化剂，也作为NF-κB特异性抑制剂。其主要通过抑制IκB降解或者抑制NF-κB (P65)，阻碍NF-κB的向核移位，从而达到抑制NF-κB活性的作用。体外实验表明，PDTC可抑制多种肿瘤细胞的增殖[11-13]。本研究采用PDTC抑制NF-κB信号通路，观察其对MM U266细胞增殖和凋亡的影响，结果表明，PDTC能呈浓度和时间依赖性抑制U266细胞的增殖，诱导其凋亡，并且有G2期阻滞的作用。这些表明PDTC通过抑制NF-κB信号通路活化抑制了MM U266细胞的增殖，其机制可能与抑制NF-κB相关抗凋亡通路有关。

Bcl-2家族是重要的凋亡调节因子，包括抗凋亡基因和促凋亡基因，其中抗凋亡蛋白成员，比如Bcl-2、Bcl-xL和Bcl-w 是通过阻碍caspase活化或线粒体膜电位的降低和细胞色素C的释放发挥作用[14]。caspase家族即半胱氨酸天冬氨酸水解酶，对于调控真核细胞凋亡过程起了重要作用，caspase的激活即代表细胞凋亡过程的进行。Caspase的一步步激活，高选择性切割一些蛋白质来诱导细胞凋亡[15-16]。在我们的研究中选择具有代表性的Bcl-2、cleaved caspase-3和cleaved caspase-8作为凋亡的观测指标，发现PDTC通过抑制NF-κB，使Bcl-2的蛋白水平降低，cleaved caspase-3和cleaved caspase-8的蛋白水平升高，且随着PDTC浓度的改变而相应的变化。细胞凋亡受细胞内外因子调控，NF-κB的激活能诱导抗凋亡基因的表达，从而促进细胞存活，因此，NF-κB是调控细胞凋亡重要的转录因子。在本研究中，我们用PDTC作用于U266细胞，抑制了NF-κB，并且可能通过降低抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，激活caspase-3等关键酶，作用于caspase-8和线粒体的上游从而诱发细胞凋亡途径。这与Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡结果一致，但其具体诱导凋亡的途径还不清楚，有待进一步研究。

我们用流式细胞术检测细胞周期时多次重复实验结果显示，与对照组比较，PDTC作用后G2期细胞相对增多，Western blot 结果显示细胞周期蛋白cyclin D1蛋白水平呈增高趋势。Hwang等[17]在研究β-catenin 和NF-κB 信号通路与cyclin D1关系时，发现cyclin D1的转录激活能被NF-κB(P65)抑制。我们的结果也显示PDTC抑制NF-κB信号通路，反馈性引起cyclin D1的表达升高。Cyclin D1调控细胞周期由G1至S期发展，这可能解释了我们的结果中S期细胞高比率的原因。而PDTC对cyclin D1的调控机制可能有待更深入的研究。

在MM中，我们前期的研究表明一种抑癌基因PCDH10由于甲基化而表达减少或缺失[18]，而甲基化过程与DNMTs (包括DNMT1、DNMT3a和DNMT3b)的表达密切相关。国内外研究证实DNMTs 在骨髓瘤中异常高表达[19]，我们前期也检测了骨髓瘤病人与正常人骨髓中DNMTs 的mRNA表达情况，得到同样的结果(数据未列出)。DNMT1是重要的甲基转移酶，其在MM U266细胞中异常高表达。有文献研究表明，在急性髓系白血病中，硼替佐米可以通过Sp1/NF-κB通路下调DNMT1的表达，从而诱导基因组DNA低甲基化[20]。因此，我们猜测NF-κB与DNMT1的表达有关，在本实验中，加入PDTC后，从RT-qPCR 和Western blot 结果中我们观察到DNMT1在基因和蛋白水平均受到明显抑制。这表明PDTC可能通过抑制NF-κB参与了对DNMT1的间接调控，也表明在多发性骨髓瘤中，NF-κB与DNMT1存在一定的联系。这一结果对于进一步研究PDTC在骨髓瘤中的作用及与抑癌基因甲基化的关系提供了依据。

综上所述，本实验通过PDTC抑制NF-κB信号通路，发现PDTC可抑制MM U266细胞的增殖，促进其凋亡，其机制可能与抑制Bcl-2的表达，活化caspase-3和caspase-8的表达有关。并且PDTC通过抑制NF-κB从而抑制DNMT1的表达，为PDTC在MM中的进一步研究应用提供了理论依据。

[1] Becker N. Epidemiology of multiple myeloma[J]. Recent Results Cancer Res, 2011, 183:25-35.

[2] Munshi NC, Anderson KC. New strategies in the treatment of multiple myeloma[J]. Clin Cancer Res, 2013,19(13):3337-3344.

[3] Karin M. Nuclear factor-κB in cancer development and progression[J]. Nature, 2006, 441(7092):431-436.

[4] Shanmugam R, Gade P, Wilson-Weekes A, et al. A noncanonical Flt3ITD/NF-κB signaling pathway represses DAPK1 in acute myeloid leukemia[J]. Clin Cancer Res, 2012, 18(2):360-369.

[5] Mansouri L, Sutton LA, Ljungström V, et al. Functional loss of IκBε leads to NF-κB deregulation in aggressive chronic lymphocytic leukemia[J]. J Exp Med, 2015, 212(6):833-843.

[6] Jost PJ, Ruland J. Aberrant NF-κB signaling in lymphoma: mechanisms, consequences, and therapeutic implications[J]. Blood, 2007, 109(7):2700-2707.

[7] Demchenko YN, Kuehl WM. A critical role for the NFkB pathway in multiple myeloma[J]. Oncotarget, 2010, 1(1):59-68.

[8] Moreau P, Attal M, Facon T. Frontline therapy of multiple myeloma[J]. Blood, 2015, 125(20):3076-3084.

[9] Dutta J, Fan Y, Gupta N, et al. Current insights into the regulation of programmed cell death by NF-κB[J]. Oncogene, 2006, 25(51):6800-6816.

[10]Demchenko YN, Glebov OK, Zingone A, et al. Classical and/or alternative NF-κB pathway activation in multiple myeloma[J].Blood, 2010, 115(17):3541-3552.

[11]Gu JW, Young E, Busby B, et al. Oral administration of pyrrolidine dithiocarbamate (PDTC) inhibits VEGF expression, tumor angiogenesis, and growth of breast cancer in female mice[J]. Cancer Biol Ther, 2009, 8(6):514-521.

[12]Cao MZ, Mao WZ, Ma GL, et al. NF-κB inhibitor PDTC enhances tumor necrosis factor alpha-induced apoptosis of gastric cancer cell SGC-7901[J]. Zhonghua Wei Chang Wai Ke Za Zhi, 2013, 16(6):578-582.

[13]Gao P, Gao YJ, Liang HL. Effect of NF- κB inhibitor PDTC on VEGF and endostatin expression of mice with Lewis lung cancer[J]. Asian Pac J Trop Med, 2015, 8(3):220-224.

[14]Gahl RF, Dwivedi P, Tjandra N. Bcl-2 proteins bid and bax form a network to permeabilize the mitochondria at the onset of apoptosis[J]. Cell Death Dis, 2016, 7(10):e2424.

[15]Choi BH, Kim W, Wang QC, et al. Kinetin riboside preferentially induces apoptosis by modulating Bcl-2 family proteins and caspase-3 in cancer cells[J]. Cancer Lett, 2008, 261(1):37-45.

[16]王立民. 人参皂苷Rh2对人骨肉瘤细胞MG-63凋亡的影响[J]. 中国病理生理杂志, 2015, 31(9):1715-1719.

[17]Hwang I, Choi YS, Jeon MY, et al. NF-κB p65 represses β-catenin-activated transcription of cyclin D1[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2010, 403(1):79-84.

[18]Li Y, Yang ZS, Song JJ, et al. Protocadherin-10 is involved in angiogenesis and methylation correlated with multiple myeloma[J]. Int J Mol Med, 2012, 29(4):704-710.

[19]鹿全意, 张泽川, 洪秀理. DNA甲基转移酶在骨髓瘤细胞株中的表达异常及其意义[J]. 中国实验血液学杂志, 2011, 19(6):1429-1431.

[20]Liu S, Liu Z, Xie Z, et al. Bortezomib induces DNA hypomethylation and silenced gene transcription by interfering with Sp1/NF-κB-dependent DNA methyltransferase activity in acute myeloid leukemia[J]. Blood, 2008, 111(4): 2364-2373.

(责任编辑： 陈妙玲， 罗 森)

Effect of NF-κB inhibitor pyrrolidine dithiocarbamate on proliferation and apoptosis of human multiple myeloma U266 cells

YI Bei, YUAN Hai-ting, XU Yong-hui, LUO Qi, ZENG Chen-si, CHEN Jian-bin

(DepartmentofHematology,TheFirstAffiliatedHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China.E-mail:cqchenjianbin2007@126.com)

AIM: To explore the effect of pyrrolidine dithiocarbamate (PDTC), an NF-κB inhibitor, on the proliferation and apoptosis of human multiple myeloma U266 cells and its mechanisms. METHODS: The U266 cells were treated with PDTC at different concentrations (0, 25, 50, 100 and 200 μmol/L)invitro. The growth inhibitory rate of the U266 cells was detected by CCK-8 assay and cell counting. The cell cycle of the U266 cells was determined by flow cyto-metry, and the apoptosis was examined by flow cytometry with Annexin V-FITC/PI staining. The effect of PDTC on the expression of DNA methyltransferase 1 (DNMT1) at mRNA and protein levels was measured by RT-qPCR and Western blot, respectively. The effects of PDTC on the protein levels of NF-κB (P65), DNMT1, Bcl-2, cyclin D1, cleaved caspase-3 and cleaved caspase-8 were determined by Western blot. RESULTS: The protein level of NF-κB (P65) was decreased after treatment with PDTC for 48 h or 72 h. PDTC inhibited the proliferation of U266 cells in both dose- and time-dependent manners. After treatment with PDTC for 48 h, the percentage of U266 cells in G2phase increased compared with control group (P<0.05). PDTC induced the apoptosis of U266 cells in a dose-dependent manner. The expression of DNMT1 at mRNA and protein levels decreased (P<0.05). The results of Western blot showed that the expression of Bcl-2 in PDTC groups decreased, while the protein levels of cyclin D1, cleaved caspase-3 and cleaved caspase-8 were higher than those in control group (P<0.05). CONCLUSION: The NF-κB inhibitor PDTC inhibits the proliferation of U266 cells by inducing cell apoptosis. It may be related to the down-regulated expression of DNMT1, cell cycle arrest and activation of the apoptotic pathways.

NF-κB; PDTC; Multiple myeloma; Apoptosis; DNA methyltransferase 1

1000- 4718(2017)07- 1177- 07

2016- 11- 10

2017- 03- 09

重庆市卫生计生委科研计划项目(No. 2011-1-032)

R733.3； R730.23

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.07.004

杂志网址： http://www.cjpp.net

△通讯作者 Tel： 023-89011522； E-mail： cqchenjianbin2007@126.com