鲜地黄花不同部位环烯醚萜苷类成分含量测定

于文娜，张振凌，李柯柯，刘艳，王胜超，赵丹

（河南中医药大学，河南郑州450003）

鲜地黄花不同部位环烯醚萜苷类成分含量测定

于文娜，张振凌*，李柯柯，刘艳，王胜超，赵丹

（河南中医药大学，河南郑州450003）

比较鲜地黄花不同部位梓醇，毛蕊花糖苷，地黄苷D及益母草苷含量，为地黄花的药用及食用提供一定参考。采用 HPLC法测定，Waters-Symmetry ShieldTMRP18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），梓醇：流动相乙腈-水（1∶99），流速1 mL/min，检测波长210 nm，柱温30℃，进样10 μL。毛蕊花糖苷：流动相乙腈-0.1%醋酸溶液（18∶82），流速1 mL/min，检测波长 334 nm，柱温 30 ℃，进样 20 μL。地黄苷 D、益母草苷：SunFireTMC18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色谱柱，乙腈-水（3∶97）为流动相；流速 1 mL/min；柱温 30℃；检测波长 203 nm；进样 20 μL。梓醇含量：花瓣>花梗>花托，最高为9.52%；毛蕊花糖苷含量：花瓣>花托>花梗，最高为0.53%；地黄苷D含量：花瓣>花梗>花托，最高为0.09%；益母草苷含量：花托>花梗>花瓣，最高为0.19%。地黄花中不同部位其有效成分含量存在显著差异。

地黄花；不同部位；梓醇；毛蕊花糖苷；地黄苷D；益母草苷

地黄花为玄参科植物地黄的花蕾，其功效与作用为治消渴，肾虚腰痛[1]。《本草图经》记载：“为末服食，功同地黄。”《纲目》曰：“治肾虚，腰脊痛，为末酒服方寸匕，日三。”且《圣济总录》中有地黄花粥的记载。近年来，地黄花也被用于药膳偏方之中，如地黄花粥可治疗消渴症等。环烯醚萜苷类化合物梓醇和苯乙醇苷类化合物毛蕊花糖苷是地黄药材质量评价的指标性成分。且现代药理研究表明梓醇具有神经保护、降血糖、利尿、缓泻、抗癌、抗炎等作用[2]；毛蕊花糖苷具有雄性激素样作用[3]，以及抗氧化、抗肿瘤、增强心血管活性等作用[4]；地黄苷等环烯醚萜苷成分研究较多，具有明显的补血作用，尤其对骨髓造血功能具有促进作用[5]。因此本试验通过HPLC法测定地黄花不同部位梓醇，毛蕊花糖苷，地黄苷D及益母草苷含量，并进行比较分析，以期为地黄花的药用及食用提供参考。

1 仪器与材料

1.1 仪器

FW-200型高速万能粉碎机：北京中兴伟业仪器有限公司；e2695型高效液相色谱仪：美国Waters公司。

1.2 材料与试剂

鲜地黄花采自河南省温县宛西地黄种植基地，经河南中医药大学生药学科董诚明教授鉴定为玄参科植物地黄（Rehmannia glutinosa Libosch）的新鲜花蕾（冷冻干燥品）；梓醇标准品（生产批号110808-201210）、毛蕊花糖苷标准品（生产批号111530-201411）：中国食品药品检定研究院；地黄苷D标准品（生产批号Y19J6F1）、益母草苷标准品（生产批号L10A6Y2298）：上海源叶生物科技有限公司；乙腈为色谱纯；水为超纯水；其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

2.1.1 梓醇色谱条件

Waters-Symmetry ShieldTMRP18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；以乙腈-水（1 ∶99）为流动相，流速1 mL/min，检测波长210 nm，柱温30℃。进样量10 μL，色谱图见图1。

图1 鲜地黄花HPLCFig.1 HPLC of fresh rehmanniae flowers

2.1.2 毛蕊花糖苷色谱条件

Waters-Symmetry ShieldTMRP18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；以乙腈-0.1%醋酸溶液（18∶82）为流动相，流速1 mL/min，检测波长334 nm，柱温30℃。进样量20 μL，色谱图见图2。

图2Fig.2 HPLC of fresh rehmanniae flowers

2.1.3 地黄苷D、益母草苷色谱条件

SunFireTMC18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色谱柱，乙腈-水（3∶97）为流动相；流速 1 mL/min；柱温 30℃；检测波长203 nm；进样量：20 μL，色谱图见图3。

图3 鲜地黄花HPLCFig.3 HPLC of fresh rehmanniae flowers

2.2 对照品溶液的制备

分别精密称取适量梓醇及毛蕊花糖苷对照品于5 mL和10 mL容量瓶中，地黄苷D及益母草苷标准品于2 mL容量瓶中，用流动相溶解并定容至刻度，摇匀，即得0.93 mg/mL的梓醇对照品溶液，1.01 mg/mL的毛蕊花糖苷对照品溶液，0.29 mg/mL的地黄苷D对照品溶液及0.39 mg/mL的益母草苷对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

2.3.1 梓醇及毛蕊花糖苷供试品溶液制备

分别取地黄花瓣，花托及花梗0.8 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，称定重量，加热回流提取1.5 h，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，精密量取续滤液（梓醇10 mL，毛蕊花糖苷20 mL）于蒸发皿中，60℃水浴浓缩至近干，残渣用流动相溶解并定容至10 mL（梓醇）和5 mL（毛蕊花糖苷）容量瓶中，摇匀，0.22 μm微孔滤膜过滤，备用。

2.3.2 地黄苷D及益母草苷供试品溶液制备

分别取地黄花瓣，花托，花梗约1.0 g，精密称定，置于150 mL具塞锥形瓶中，精密加入60%甲醇水溶液100 mL，轻轻振摇使其与溶剂充分接触并混匀，称定重量，超声辅助提取（40 kz，500 W）40 min，取出冷却至室温，称定重量，以提取溶剂补足失重，过滤，弃去初滤液，精密量取20 mL续滤液于蒸发皿中，60℃水浴浓缩至近干，以流动相溶解并定容至5 mL容量瓶中，0.22 μm微孔滤膜过滤，备用。

2.4 线性关系考察

分别精密吸取梓醇，毛蕊花糖苷对照品溶液1、5、10、15、20 μL，地黄苷 D 及益母草苷对照品溶液 1、3、5、7、9 μL，按 2.1 项下色谱条件测定，以峰面积为纵坐标，进样量为横坐标，得线性回归方程分别为Y=260 336X-39 493（R2=0.999 8），Y=2×106X-690 748（R2=0.999 9），Y=513 027X-46 894（R2=1.000），Y=542 565X-71 693（R2=1.000），线性范围依次为 0.93 μg～18.6 μg、1.01 μg～20.2 μg、0.29 μg～2.61 μg、0.39 μg～3.51 μg。

2.5 精密度试验

取地黄花瓣供试品溶液，按2.1项下色谱条件，计算梓醇，毛蕊花糖苷，地黄苷D及益母草苷峰面积积分值的RSD分别为0.91%、0.52%、1.47%、1.88%。说明仪器精密度良好。

2.6 重复性试验

取地黄花瓣样品，按2.3项下方法平行制备6份供试品溶液，按2.1项下色谱条件测定，结果梓醇，毛蕊花糖苷，地黄苷D及益母草苷峰面积积分值的RSD分别为0.58%、1.72%、0.34%、0.27%。说明该方法重复性良好。

2.7 稳定性试验

取地黄花瓣供试品溶液，分别在 0、2、4、8、12、24 h按2.1项下色谱条件进样，结果梓醇，毛蕊花糖苷，地黄苷D及益母草苷峰面积积分值的RSD分别为1.15%、0.47%、0.46%、0.30%。表明供试品溶液在24 h内基本稳定。

2.8 加样回收率试验

取地黄花托6份，每份0.4 g，分别精密加入梓醇（4.01 mg/mL）5 mL，毛蕊花糖苷（1.47 mg/mL）对照品溶液1 mL，以2.3.1项下方法制备供试品溶液；取地黄花托6份，每份0.5 g，分别精密加入地黄苷D（0.26 mg/mL）1 mL，益母草苷（0.97 mg/mL）1 mL对照品溶液，以2.3.2项下方法制备供试品溶液，分别进样测定，结果梓醇，毛蕊花糖苷，地黄苷D及益母草苷回收率RSD值分别为1.28%、1.23%、0.80%、0.93%，说明回收率良好，该方法准确可靠。梓醇及毛蕊花糖苷具体结果见表1。

表1 梓醇及毛蕊花糖苷加样回收试验结果Table 1 Recovery tests of catalpol，verbascoside in fresh of rehmanniae flowers

2.9 样品测定

取地黄花瓣，花托，花梗样品，按2.3项下方法制备供试品溶液，平行3份，根据水分测定结果换算为干燥品计算地黄花不同部位中梓醇，毛蕊花糖苷，地黄苷D及益母草苷的含量，取平均值，结果见表2。

表2 地黄花不同部位梓醇，毛蕊花糖苷，地黄苷D及益母草苷含量测定Table 2 Contents of catalpol，verbascoside ，rehmaionoside D and leonuride in rehmanniae flowers

结果表明梓醇，毛蕊花糖苷及地黄苷D以地黄花瓣中含量最高，益母草苷在地黄花托中含量为最高。

3 讨论

本试验在药典法的基础上，对地黄花不同部位梓醇及毛蕊花糖苷进行含量测定，对梓醇含量测定流动相进行调整，最终采用乙腈-水（1∶99）；同时调整毛蕊花糖苷含量测定流动相比例为乙腈-0.1%醋酸（18∶82）。在相关研究文献[6-7]的基础上，采用HPLC法同时测定地黄花中地黄苷D及益母草苷3种有效成分含量，并适当调整流动相比例，最终确立采用乙腈-水（3 ∶97）。

本研究采用的新鲜地黄花样品，因其不易保存，故均通过本试验室冷冻干燥设备自制成地黄花冷冻干燥品，以备试验使用。由试验结果可知，地黄花不同部位梓醇等有效成分含量虽存在很大差异，但其含量均较高。其中梓醇，毛蕊花糖苷及地黄苷D含量在地黄花瓣中为最高，分别为9.52%、0.53%、0.09%，益母草苷含量则在地黄花托中为最高，0.19%。这不仅说明在以地黄花为材料的药膳偏方对于相关疾病的辅助治疗方面有一定现实应用价值，而且也为地黄花的使用提供理论和科学依据。且梓醇，毛蕊花糖苷等是地黄中的主要有效成分，通过比较地黄花不同部位（花瓣，花托及花梗）有效成分含量，发现均超过相关文献[8-9]鲜地黄中梓醇等有效成分含量，可考虑将地黄花入药或者作为提取物的制备原料，为地黄扩大药源及食品相关领域提供参考。

[1]江苏新医学院.中药大辞典(上册)[M].上海：上海科学技术出版社,1985：826

[2]刘彦飞,赵宇,温学森,等.梓醇的药效学及化学转化研究现状[J].中国中药杂志,2007,31(12)：1128-1130

[3]何伟,宗桂珍,武桂兰,等.肉苁蓉中雄性激素样作用活性成分的初探[J].中国中药杂志,1996,9(9)：52-53

[4]Zhang H Q,Lai Y L.Acteaside inhibits apoptosis in a D-galactasam ine and lipopolysaccharide-induced liver injury[J].Life Sci,1999,65(4)：421

[5]于震,王军,李更生,等.地黄甙D滋阴补血和降血糖作用的实验研究[J].辽宁中医杂志,2001(4)：240-242

[6]刘炯,张杰,张华锋,等.HPLC测定不同品种怀地黄中地黄苷A、D的含量[J].药物分析杂志,2014(2)：335-339

[7]李更生,刘明,王慧森,等.地黄药材炮制过程中环烯醚萜苷类成分动态变化的研究[J].中国中医药科技,2008(6)：440-442

[8]吴若男,张振凌,刘艳,等.微波干燥对鲜地黄中地黄苷A,D和益母草苷含量的影响[J].中国实验方剂学杂志,2016(8)：28-31

[9]王宏洁,金亚红,李鹏跃,等.鲜、生、熟地黄药材中3种活性成分含量的比较[J].中国中药杂志,2008(15)：1923-1925

Determination of the Content of Iridoid Glycosidein from Different Parts of the Fresh Rehmanniae Flowers

YU Wen-na，ZHANG Zhen-ling*，LI Ke-ke，LIU Yan，WANG Sheng-chao，ZHAO Dan
（Henan University of Traditional Chinese Medicine，Zhengzhou 450003，Henan，China）

Compared the contents of catalpol，verbascoside ，rehmaionoside D and leonuride in rehmanniae flowers，for the flower's medicinal and edible aspects provide certain reference.Contents of catalpol，verbascoside ，rehmaionoside D and leonuride were determined by HPLC，Waters-Symmetry ShieldTMRP18 column（4.6 mm × 250 mm，5 μm），catalpol：a mobile phase of acetonitrile-water （1 ∶99）was used，flow rate was 1 mL/min，column temperature was set at 30 ℃ ，a UV detector was applied with wavelength of 210 nm，sample volume10μL.Verbascoside：a mobile phase of acetonitrile-0.1%acetic acid solution （18 ∶82）as mobile phase，flow rate was 1 mL/min，column temperature was set at 30 ℃ ，a UV detector was applied with wavelength of 334 nm，sample volume 20 μL.Rehmaionoside D and leonuride：SunFireTMC18 column（4.6 mm × 250 mm，5 μm），a mobile phase of acetonitrile-water （3 ∶97）was used，flow rate was 1 mL/min，column temperature was set at 30 ℃ ，a UV detector was applied with wavelength of 203 nm，sample volume 20 μL.The content of catalpol content：petals>pedicel>receptacle，as high as 9.52%；verbascoside content：petals>receptacle>peduncle，up to 0.53%；rehmaionoside D levels：petals>pedicel>receptacle，as high as 0.09%；leonuride content：receptacle>pedicel>petals，as high as 0.19%.There are significant differences among different parts of the active ingredient content of rehmanniae flowers.

fresh rehmannine flowers；different parts；catalpol；verbascoside；rehmaionoside D；leonuride

2016-10-24

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.14.028

公益性科研专项项目（201507002）；科研创新基金项目（教科计[2013]638号）

于文娜（1990—），女（汉），在读研究生，研究方向：中药饮片及新药研究。

*通信作者：张振凌，从事中药饮片及新药研究。