竹柳叶中黄酮类化合物的提取工艺和成分分析研究

韩颖，吕晓玲

（天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津300457）

竹柳叶中黄酮类化合物的提取工艺和成分分析研究

韩颖，吕晓玲

（天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津300457）

以竹柳叶为原料，采用乙醇回流提取法对竹柳叶黄酮的提取工艺进行研究，确定最优提取工艺，并对黄酮类成分进行初步分析。在单因素试验的基础上，以黄酮得率为指标，选取提取温度、料液比、乙醇浓度、提取时间4个因素进行正交试验，对提取工艺进行优化。采用高效液相-离子阱-飞行时间质谱（LCMS-IT-TOF）技术对黄酮成分进行分析。结果表明：竹柳叶黄酮的最佳提取工艺为提取温度80℃、料液比1∶40（g/mL）、乙醇浓度55%、提取时间2 h，此条件下，黄酮得率为4.0%。共推测出6种黄酮类化合物，即异牡荆素-7-O-葡萄糖苷、芦丁、木犀草素-7-O-葡萄糖苷、异鼠李素-3-O-芸香糖苷、芹黄素-7-O-葡萄糖醛酸苷、金圣草素-葡萄糖醛酸苷。

竹柳叶；黄酮；提取；分析

竹柳为杨柳科柳属植物，是从美国引进的一个多元杂交速生新树种，属于落叶乔木，生长潜力大。该树种速生性好、高密植性、适应性强，是一种良好的木材，常用于生产新型燃料，防风固沙，保护生态环境[1]。竹柳在工业生产，环境保护等方面作用巨大，但目前对于竹柳中的活性成分还没有研究，通过试验发现竹柳叶中含有较高含量的黄酮类化合物，对竹柳的综合利用起到一定作用。

黄酮类化合物是以黄酮（2-苯基色原酮）为母核而衍生的一类化合物[2]，黄酮类化合物以C6-C3-C6的形式建立其骨架，而苯基间的三碳桥常与氧发生环化[3]。分为黄酮类、黄酮醇类、异黄酮类、黄烷酮类等。黄酮类化合物具有多种生理活性，人体摄入后具有较强的抗氧化作用，以及明显的降血脂、抗衰老、抑菌、抗病毒、抗炎镇痛等功效[4-6]。

本试验对竹柳叶中的黄酮类化合物的提取工艺进行研究，并利用LCMS-IT-TOF技术其黄酮成分进行初步分析。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

竹柳叶：甘肃省宝纳有年金龙林业有限公司提供，晒干后粉碎过30目筛，密封保存备用；芦丁标准品、无水乙醇、氢氧化钠、亚硫酸钠、硝酸铝（均为分析纯）：北京化学试剂公司；乙腈、乙酸、甲醇（均为色谱纯）：天津市化学试剂供销公司；超纯水：由Millipore超纯水机制得。

DFY-500型植物粉碎机：上海仪器仪表科技有限公司；CP214型电子天平：奥豪斯仪器有限公司；756PC型紫外可见分光光度计：上海光谱仪器有限公司；SHB-III型循环水式多用真空泵：郑州长城科工贸有限公司；EMS-20水浴磁力搅拌器：天津欧诺仪器仪表有限公司；RE-2000型旋转蒸发器：上海亚荣生化仪器厂；LCMS-IT-TOF：日本岛津公司。

1.2 黄酮类化合物提取工艺的研究

1.2.1 黄酮含量的测定

1.2.1.1 芦丁标准曲线的制作

准确称取11.25 mg芦丁标准品于25 mL容量瓶中，75%乙醇定容，即得0.45 mg/mL的芦丁标准溶液，精确移取标准品溶液 0、0.25、0.50、1.00、1.25、1.50、1.75 mL于10 mL容量瓶中，分别加入5%NaNO2溶液0.3mL，摇匀静置6min，加入10%Al（NO3）3溶液0.3mL，摇匀静置6 min，加4%NaOH溶液4 mL，加75%乙醇定容，摇匀静置12 min，按照分光光度法，在510 nm处测吸光度A，以吸光度A为纵坐标，芦丁质量浓度C为横坐标绘制标准曲线。

1.2.1.2 样品黄酮含量的测定

准确吸取适量样品粗提液于10 mL比色管中，按上述方法测吸光度，并计算黄酮得率（%，以芦丁计）。

式中：C为粗提液的质量浓度，mg/mL；N为稀释倍数；V为粗提液体积，mL；m为样品质量（干基），mg。

1.2.2 提取工艺单因素试验

1.2.2.1 提取温度的选择

料液比为1∶20（g/mL），乙醇浓度为75%，提取时间为 1.5 h，分别在 50、60、70、80、90 ℃的温度下，提取1.5 h，测定黄酮得率。

1.2.2.2 料液比的选择

提取温度为80℃，乙醇浓度为75%，提取时间为1.5 h，料液比分别为 1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（g/mL），测定黄酮得率。

1.2.2.3 乙醇浓度的选择

提取温度为 80℃，料液比为 1∶30（g/mL），提取时间为1.5 h，分别用浓度为55%、65%、75%、85%、95%的乙醇，测定黄酮得率。

1.2.2.4 提取时间的选择

提取温度为 80℃，料液比为 1∶30（g/mL），乙醇浓度为 65%，提取时间分别为 1、1.5、2、2.5、3 h，测定黄酮得率。

1.2.3 提取工艺正交试验

在单因素试验结果的基础上，对提取温度、料液比、乙醇浓度和提取时间4个因素进行四因素三水平正交试验，见表1。

表1 正交试验因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.3 黄酮类化合物成分分析

1.3.1 样品制备

取竹柳叶粉末1.0 g，加40 mL 55%乙醇，回流提取2 h，滤液旋蒸，冻干，得黄酮样品；取适量黄酮样品溶于甲醇中，用0.22 μm微孔滤膜过滤，取滤液供LCMS分析。

1.3.2 液质联用分析（LCMS-IT-TOF）

1.3.2.1 液相色谱条件

色谱柱：GeminiC18色谱柱（250mm×4.6mm，5μm）；流动相：A相为0.1%乙酸水溶液，B相为乙腈，梯度洗脱（0～5 min，20%～22%B；5 min～8 min，22%～25%B；8 min～10 min，25%～27%B；10 min～20 min，27%～28%B；20 min～25 min，28%～30%B；25 min～30 min，30%B）；流速：1 mL/min；进样量：3 μL；柱温：30 ℃；检测器：紫外检测器；波长：330 nm。

1.3.2.2 质谱条件

离子源：ESI；扫描模式：正离子扫描；m/z扫描范围：50～1 000；电喷雾电压：4.5 kV；雾化气流速：1.5 L/min；干燥气（N2）压力：0.1 MPa；CDL 温度：200℃；加热模块（BH）温度：200℃；检测器电压：1.54 kV。

2 结果与分析

2.1 黄酮类化合物提取工艺的确定

2.1.1 黄酮含量的测定

芦丁标准曲线的回归方程为：y=12.86 1x-0.015 9（R2=0.999 3），式中：y为吸光度值，x为溶液的浓度，R2为相关系数。结果表明，芦丁在0.011 25 mg/mL～0.078 75 mg/mL浓度范围内，线性良好。

2.1.2 单因素试验结果

2.1.2.1 提取温度对得率的影响

提取温度对得率的影响见图1。

图1 提取温度对得率的影响Fig.1 Effects of extraction temperature on yield of flavonoids

由图1看出，黄酮的得率随着温度的升高而增加，而当温度超过80℃时，黄酮的得率变化不大，这可能是因为温度的升高会加快分子的运动，也能软化并破坏细胞壁结构使黄酮类成分流出。从节能的角度考虑，选择提取温度为80℃为宜。

2.1.2.2 料液比对得率的影响

料液比对得率的影响见图2。

图2 料液比对得率的影响Fig.2 Effects of liquid-solid ration on yield of flavonoids

从图2可以看出，当料液比为1∶30（g/mL）时，黄酮类化合物的得率最高，当料液比大于1∶30（g/mL）时，总黄酮得率反而降低，之后黄酮得率变化不大。这可能是因为溶剂量过多时，一些其他类物质也被提取出来，使黄酮得率呈下降趋势。故选择料液比为1∶30（g/mL）为宜。

2.1.2.3 乙醇浓度对得率的影响

乙醇浓度对得率的影响见图3。

图3 乙醇浓度对得率的影响Fig.3 Effects of ethanol concentration on yield of flavonoids

从图3可知，当乙醇浓度为65%时，黄酮得率达到最大值，可能是因为浓度为65%的乙醇溶液的极性与黄酮类化合物的极性相近，更易提取出黄酮类物质，之后乙醇浓度增加，得率反而降低，这可能是因为乙醇浓度高时，一些醇溶性的杂质、色素、亲脂性强的成分也溶出，导致黄酮的得率下降。故选乙醇浓度为65%。

2.1.2.4 提取时间对黄酮得率的影响

提取时间对得率的影响见图4。

图4 提取时间对得率的影响Fig.4 Effects of extraction time on yield of flavonoids

从图4可以看出，随着提取时间的增加，黄酮得率先增加，之后趋于平稳，这是因为提取时间越长，溶剂越能够充分渗透到细胞内与活性物质接触溶解，使黄酮溶出，得率增加。故选提取时间为1.5 h为宜。

2.1.3 正交试验结果与分析

正交试验直观分析见表2，正交试验方差分析见表3。

表2 正交试验直观分析Table 2 Intuitive analysis of orthogonal experiment

续表2 正交试验直观分析Continue table 2 Intuitive analysis of orthogonal experiment

表2和表3结果表明，4个因素对黄酮得率的影响顺序从大到小依次为C>B>A>D，最佳提取工艺组合为A2B3C1D3，但这个提取工艺不包括在正交试验分析表中，需做验证试验。经验证，在此工艺条件下，得到黄酮得率为4.0%。因此，最佳工艺为A2B3C1D3，即提取温度为80℃，料液比为1∶40（g/mL）、乙醇浓度为 55%、提取时间为2 h。料液比和乙醇浓度这两个因素对黄酮得率影响显著。

表3 正交试验方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiment

2.2 黄酮成分分析

黄酮样品的液相色谱图见图5。

图5 竹柳叶中黄酮类化合物的液相色谱图Fig.5 HPLC chromatograms of flavonoids in bamboo willow leaves

由图5可知，在此液相条件下，样品中的黄酮成分得到较好分离。根据一、二级质谱图对液相色谱图的色谱峰进行分析，推断出6个黄酮类化合物。

2.2.1 化合物I的结构分析

化合物I的一、二级质谱图见图6。

图6 化合物I的一、二级质谱图Fig.6 MS/MS2spectrum of compound I

由图6可知，正离子扫描的m/z为595.164 5，为[M+H]+峰，表明该化合物的相对分子量为594。m/z 595.164 5离子进行二级质谱分析，产生的主要碎片离子为：m/z577.154 1和m/z457.113 3，根据质谱数据、裂解途径及相关文献[7]，推测该化合物为异牡荆素-7-O-葡萄糖苷。

2.2.2 化合物II的结构分析

化合物II的一、二级质谱图见图7。

图7 化合物II的一、二级质谱图Fig.7 MS/MS2spectrum of compound II

由图7看出，正离子扫描的m/z为611.160 8，是[M+H]+峰，表明该化合物的相对分子量为610。对m/z 611.160 8离子进行二级质谱分析，得到的主要碎片离子是m/z303.049 8和m/z465.105 1，m/z 465.105 1为母离子m/z611.1608失去一个质量数146（鼠李糖）得中性碎片后生成的离子[M+H-146]+，在此基础上又失去一个质量数162（葡萄糖）的中性碎片后生成m/z 303.049 8[M+H-146-162]+，此碎片离子可能是化合物II的组成苷元槲皮素，根据质谱数据、裂解途径及相关文献[8]，推测该化合物为芦丁。

2.2.3 化合物III的结构分析

化合物III的一、二级质谱图见图8。

图8 化合物III的一、二级质谱图Fig.8 MS/MS2spectrum of compound III

由图8可知，正离子扫描的m/z为449.108 2，是[M+H]+峰，表明该化合物的相对分子量为448。二级碎片离子为m/z287.055 1，表明该化合物的组成苷元可能为木犀草素，根据质谱数据、裂解途径及相关文献[7，9]，推测该化合物为木犀草素-7-O-葡萄糖苷。

2.2.4 化合物IV的结构分析

化合物IV的一、二级质谱图见图9。

图9 化合物IV的一、二级质谱图Fig.9 MS/MS2spectrum of compound IV

图9表明，正离子扫描的m/z为625.175 8，是[M+H]+峰，表明该化合物的相对分子量为624，在其二级质谱图中可以看到m/z317.068 3的碎片离子，说明该化合物的组成苷元是异鼠李素，此碎片离子是通过母离子m/z625.175 8失去一个质量数308（葡萄糖+鼠李糖）的中性碎片形成的，根据质谱数据、裂解途径及相关文献[10]，推测该化合物为异鼠李素-3-O-芸香糖苷。

2.2.5 化合物V的结构分析

化合物V的一、二级质谱图见图10。

图10 化合物V的一、二级质谱图Fig.10 MS/MS2spectrum of compound V

由图10可知，正离子扫描的m/z为447.092 6，是[M+H]+峰，表明该化合物的相对分子量为448，二级碎片离子为m/z271.060 2，表明该化合物的组成苷元为芹黄素，m/z 271.060 2碎片离子是母离子m/z447.092 6失去一个质量数176（葡萄糖醛酸）的中性碎片后生成的离子[M+H-176]+，根据质谱数据、裂解途径及相关文献，推测该化合物为芹黄素-7-O-葡萄糖醛酸苷。

2.2.6 化合物VI的结构分析

化合物VI的一、二级质谱图见图11。

图11 化合物VI的一、二级质谱图Fig.11 MS/MS2spectrum of compound VI

由图11可知，正离子扫描的m/z为477.102 2，是[M+H]+峰，表明该化合物的相对分子量为478，二级碎片离子m/z301.069 8为该化合物的苷元组成，推测该苷元为金圣草素，根据质谱数据、裂解途径及相关文献，推测该化合物为金圣草素-葡萄糖醛酸苷。

3 结论

选用竹柳叶为原料，采用乙醇回流提取法对黄酮的提取工艺进行了研究，用单因素试验和正交试验优化提取工艺，得出最优提取工艺为提取温度80℃、料液比1∶40（g/mL）、乙醇浓度55%、提取时间2 h。利用LCMS-IT-TOF技术分析了其中的6种黄酮类成分，为竹柳叶中黄酮类物质的研究提供了理论依据。

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Research of Extraction Process and Analysis of Flavonoids from Bamboo Willow Leaves

HAN Ying，LÜ Xiao-ling

（Institute of Food Engineering and Biotechnology，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China）

The ethanol refluxing extraction process of flavonoids from bamboo willow leaves was studied to determine the optimal extraction conditions.The flavonoids were also analyzed.Based on the single-factor tests，the ethanol refluxing extraction conditions of flavonoids were optimized by orthogonal experiment concluding extraction temperature，liquid-solid ration，ethanolconcentr-ation and extraction time in order to increase the yield of flavonoids.The liquid chromatography-mass spectrometry-ion trap-time-of-flight（LCMS-IT-TOF）method was applied to analyze flavonoids from bamboo willow leaves.The reswlts showed that：The optimal extraction conditions of flavonoids were extraction temperature of 80 ℃，material-liquid ratio of 1 ∶40（g/mL），ethanol concentration of 55%and extraction time of 2 h.Under the optimal conditions，the maximum yield of flavonoids was 4.0%.Six flavonoids including isovitexin-7-O-glucoside，rutin，luteolin-7-O-glucoside，isorhamnetin-3-O-rutinoside，apigenin-7-O-glucuronide and chrysoeriol-glucuronide were speculated.

bamboo willow leaves；flavonoids；extraction；analysis

2016-11-12

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.14.012

韩颖（1989—），女（汉），硕士研究生，研究方向：食品添加剂与功能配料。