产肠毒素性大肠杆菌侵染猪肠上皮细胞后DLG5基因的表达变化分析

吴嘉韵++吴森++戴超辉++吴圣龙++包文斌

摘要：为了揭示DLG5基因在机体抵抗大肠杆菌刺激过程中发挥的功能，本试验利用产肠毒素性大肠杆菌（F18ab、F18ac和K88ac）侵染猪肠上皮细胞系（IPEC-J2）模拟个体的致病过程，用实时荧光定量检测DLG5基因在感染前后的表达变化情况，在细胞水平上探讨DLG5基因表达水平与产肠毒素性大肠杆菌抗性的关系。结果表明，3种大肠杆菌的菌清和菌体刺激IPEC-J2后，DLG5基因表达水平均发生显著或极显著上调；并且由F18ab和K88ac这2种菌体刺激后DLG5基因表达水平上调的程度要极显著高于F18ac菌体刺激后的表达水平。[JP3]本研究结果提示，猪DLG5基因表达和大肠杆菌的抗性具有密切关系，可能与其在一定程度上能够促进肠道屏障的结构稳定和功能发挥有关。

关键词：猪；DLG5基因；产肠毒素性大肠杆菌；抗病育种；表达水平；肠上皮细胞

中图分类号： S828文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2017）09-0127-03

仔猪断奶前后腹泻是规模化猪场最常见的疾病。产肠毒素性大肠杆菌（enterotoxigenic Escherichia coli，简称ETEC）是引起断奶前后腹泻的主要病原菌。仔猪断奶后，小肠的形态和功能都发生相应的变化[1]。此外，断奶期间消化酶的活性降低，影响肠黏膜的修复和结构的完整性[2]，导致大量致病性大肠杆菌的入侵从而引起疾病，因此仔猪肠道黏膜结构完整性是抵抗产肠毒素性大肠杆菌等外来病原菌侵袭的基本保障[3]，同时是维持肠道屏障相关基因（蛋白）表达对腹泻的抗性具有的重要调控作用[4]。

DLG5（discs large homologs 5）基因位于10号染色体q23，全长约79 kb，含32个具有编码功能的外显子，其编码的蛋白是膜结合相关的鸟苷酸激酶（membrane-associated guanylate kinase，MAGUK）家族成员之一，主要参与细胞内的信号传导并起到构建细胞骨架的作用[5]。有相关研究证明，DLG5基因还具有稳定顶端蛋白复合体的功能，与上皮细胞的完整性和极性的保持有关[6]。课题组前期筛选出miR-192和 miR-215可能是调控断奶仔猪抗F18大肠杆菌感染的重要miRNAs，而DLG5基因就是两者共同靶向调控的关键靶基因，结合DLG5基因的生物学功能，初步表明猪DLG5基因可能与断奶仔猪肠道上皮的完整性以及大肠杆菌的抗性密切相关[7-8]。为进一步揭示DLG5基因在机体抵抗大肠杆菌刺激过程中发挥的功能，本试验在细胞水平上利用产肠毒素性大肠杆菌（F18ab、F18ac和K88ac）侵染猪肠上皮细胞系（IPEC-J2），用实时荧光定量检测DLG5基因在侵染前后的表达变化情况，分析DLG5基因的表达水平与大肠杆菌侵染的关系，为下一步探讨DLG5基因的功能提供更加直接的参考依据。

1材料与方法

1.1试验材料

猪肠上皮细胞系（IPEC-J2）和大肠杆菌（F18ab、F18ac和K88ac）由扬州大学兽医学院畜禽病原微生物研究室惠赠；DMEM培养基、F12培养基、LB培养基、胎牛血清（FBS）均购自Gibco公司（美国）；PBS磷酸缓冲液（干粉）购自北京赛因坦科技有限公司（中国，北京）；Trizol裂解液购自Invitrogen公司（美国）；反转录试剂盒和荧光定量PCR试剂盒购自南京诺唯赞生物科技有限公司。

1.2IPEC-J2细胞的培养

将IPEC-J2细胞以1×106个/孔的密度接种到3板12孔板中，用含10% FBS的完全培养液（DMEM与F12培养基 1 ∶1 混合）在恒温培养箱（37 ℃，5% CO2）中培养至密度达到约90%。

1.3大肠杆菌菌液侵染IPEC-J2细胞

将大肠杆菌F18ab、F18ac和K88ac分别接种至LB培养液，在恒温摇床（37 ℃，200 r/min）中摇菌12 h，离心（4 000 r/min，10 min），分别收集菌清和菌体。向“1.2”步骤中2板12孔板的每个培养孔（处理孔和培养孔各设3个重复）各加200 μL上清液和800 μL培养液，放于恒温培养箱（37 ℃，5% CO2）分别孵育4、8 h后收集细胞用于提取总RNA。

1.4大肠杆菌菌体侵染IPEC-J2细胞

将上一步骤中收集的菌体用PBS缓冲液洗涤并离心（重复3次）。用细胞培养液将细菌稀释至1.0×109 CFU/mL，每个培养孔（处理孔和培养孔各设3个重复）加入1.0 mL细菌悬液，于恒温培养箱（37 ℃，5% CO2）孵育4 h后收集細胞用于提取总RNA。

1.5引物设计及合成

根据GenBank数据库中DLG5基因序列（登录号：XM_005671132.1），利用Oligo 7.0软件设计Real-time PCR引物，为避免基因组DNA污染，引物跨外显子设计；以GAPDH基因作为内参，引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。引物信息见表1。

1.6细胞总RNA提取和cDNA合成

利用Trizol法提取各孔板细胞总RNA，提取步骤严格按照Trizol Reagent说明书操作，并以1%甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整程度，使用ND-1000核酸/蛋白浓度测定仪测定浓度及纯度，产物-70 ℃保存备用。

cDNA合成反应体系（10 μL）为：5×qRT SuperMix Ⅱ 2 μL，总RNA 500 ng，RNase free ddH2O补足至10 μL。反应条[JP3]件为：25 ℃ 10 min，50 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min，产物4 ℃保存备用。

1.7实时荧光定量

实时荧光定量反应体系为：模板cDNA 2.0 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各0.4 μL，2×SYBR Premix ExTapTM Ⅱ 10 μL，50×ROXReference Dye Ⅱ 0.4 μL，RNase free ddH2O补足至总体积20 μL。扩增程序为：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，共40个循环。扩增结束后进行熔解曲线的分析，具体程序为：95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s。每个样本设置3个重复。

1.8数据统计分析

相对定量的结果采用2-ΔΔCt法进行分析处理，并利用SPSS 17.0软件一般线性模型（general linear model，GLM）的Univariate统计方法分析不同菌体刺激的差异显著性，数据用“平均值±标准差”表示。

2结果与分析

2.1总RNA的纯度与完整性检测

提取的细胞总RNA经1%甲醛变性琼脂糖凝胶电泳，呈现清晰的28S、18S、5S共3条带，无DNA污染条带及明显降解，NanoDrop ND-1000核酸/蛋白浓度测定仪检测RNA纯度，样本的D260 nm/D280 nm为1.8～1.9，说明RNA提取的完整性和纯度较高，可用于后续试验。

2.2荧光定量PCR的扩增曲线与熔解曲线

根据荧光值的变化，系统自动生成反应循环数与检测荧光量变化的扩增反应动力学曲线，而扩增产物的特异性由熔解曲线可以判断。由图1可知，DLG5基因成功实现扩增，且qPCR产物只有1个特异峰，无引物二聚体及非特异性产物生成。

2.3大肠杆菌菌清刺激IPEC-J2细胞4 h和8 h后DLG5基因的表达水平

分别以未经大肠杆菌刺激处理的对照组表达水平为1，将3种大肠杆菌菌清侵染4 h和8 h后细胞中DLG5基因 mRNA 的表达水平进行均一化处理。由图2可知，F18ab和K88ac菌清刺激猪肠上皮细胞4 h后，DLG5基因表达水平均发生显著上调（P<0.05），F18ac菌清刺激4 h后，DLG5基因表达水平发生极显著上调（P<0.01），但是3种菌清刺激4 h后DLG5基因相对表达水平无显著差异（P>0.05）。3种大肠杆菌菌清刺激猪肠上皮细胞8 h后，DLG5基因表达水平均发生极显著上调（P<0.01），且3种大肠杆菌菌清处理8 h后细胞中DLG5基因相对表达水平都没有显著差异（P>0.05）。结果还显示，3种大肠杆菌菌清刺激处理8 h后DLG5基因表达[CM（25]水平上调的程度均极显著高于处理4[KG*3]h后的上调程度 （P<0.01）。

2.4DLG5基因在大肠杆菌菌体刺激IPEC-J2后的表达水平

以未经大肠杆菌刺激处理的对照组表达水平为1，对3种大肠杆菌刺激处理的细胞中DLG5基因mRNA的表达水平进行均一化处理。由图3可知，3种大肠杆菌刺激IPEC-J2后，DLG5基因表达水平均发生极显著上调（P<0.01），差异倍数分别为4、2、4倍；并且F18ab和K88ac这2种菌体刺激后DLG5基因表达水平上调的程度要极显著高于F18ac菌体刺激后的表达水平（P<0.01），但是F18ab和K88ac这2种菌体刺激后DLG5基因表达水平无显著差异（P>0.05）。

3讨论

产肠毒素性大肠杆菌（ETEC）是引起断奶前后仔猪腹泻和水肿的主要病原菌，菌体表面特异菌毛按黏附素（菌毛）性质可将E.coli分为F18、K88、K99、F41、987P等，ETEC通过表面菌毛黏附于仔猪小肠黏膜上皮细胞上的刷状缘受体，定居并大量繁殖，同时产生肠毒素，刺激小肠黏膜细胞，破坏肠上皮细胞结构，最后引起仔猪腹泻、脱水甚至死亡[9，11]。大量研究报道认为DLG5基因是人炎症性肠病（inflammatory bowel disease，IBD）的候选易感基因，而IBD的特征之一为肠上皮屏障功能受损[5，12]。DLG5蛋白广泛分布于机体心脏、肝脏、肠道上皮等组织[13]，能與其他蛋白互作形成蛋白复合物，再与多种信号转导蛋白连结，在维持上皮细胞结构、信号传递和维持细胞骨架等过程中发挥重要作用[14]。因此，当机体肠道受到外源感染时，DLG5的较高水平表达可能会在一定程度上缓解肠道组织细胞的增殖和凋亡，降低病原的侵染速率。结合本次试验结果，3种大肠杆菌的菌清或菌体刺激IPEC-J2后，细胞中DLG5基因的相对表达均显著上调，且用菌清刺激IPEC-J2细胞的时间越久，DLG5基因的相对表达水平越高，进一步证实了DLG5在一定程度上能够促进肠道屏障的结构稳定和功能发挥，并且在大肠杆菌侵袭仔猪肠道中发挥了重要的调控作用。本次试验结果还显示，F18ab和K88ac这2种菌体刺激引起DLG5基因表达上调的程度均极显著高于F18ac（P<0.01），这从一定程度上说明了不同种类的大肠杆菌对机体的侵袭能力可能存在差异，F18ab和K88ac这2种大肠杆菌对小肠上皮细胞的侵袭能力要强于F18ac。此外，大肠杆菌菌体刺激4 h后和菌清刺激8 h后的引起的DLG5基因表达都极显著上调（P<0.01），菌体引起的差异倍数分别为4、2、4倍，而菌清引起的差异倍数均为2倍，由此可见大肠杆菌菌体对小肠上皮细胞的侵袭能力要强于大肠杆菌菌清。

体外模拟个体的致病过程，特别是以宿主细胞为素材进行相关研究是验证基因功能的重要手段。为了在细胞水平揭示DLG5基因在机体抵抗大肠杆菌刺激过程中发挥的功能，本研究利用3种大肠杆菌的菌清和菌体刺激IPEC-J2细胞，通过分析刺激前后细胞中DLG5基因的表达变化，初步证实了DLG5基因在大肠杆菌刺激过程中确实发挥了一定的调控作用；但考虑到离体培养的猪肠上皮细胞系并不能完全模拟体内肠道组织的生长环境，所以本研究只能初步说明DLG5基因的表达和大肠杆菌的抗性具有密切关系，DLG5基因在大肠杆菌刺激过程中的调控作用及其机制还有待进一步研究。下一步还将利用基因敲除和干扰技术，结合转录组分析和转基因动物模型制备等手段，在动物模型上进行大肠杆菌体外攻毒试验，并在群体水平中进行系统分析验证，以期为猪抗大肠杆菌病分子选育工作提供指导和依据。

参考文献：

[1]Cabrera R A，Usry J L，Arrellano C，et al. Effects of creep feeding and supplemental glutamine or glutamine plus glutamate （Aminogut） on pre- and post-weaning growth performance and intestinal health of piglets[J]. Journal of Animal Science and Biotechnology，2013，4（1）：29.

[2]Godlewski M M，Bierla J B，Strzalkowski A，et al. A novel cytometric approach to study intestinal mucosa rebuilding in weaned pigs fed with dietary nucleotides[J]. Livestock Science，2009，123（2）：215-220.

[3]谢天宇，胡红莲，高民. 肠黏膜免疫屏障及其保护措施[J]. 动物营养学报，2014，26（5）：1157-1163.

[4]张影超，王希彪，崔世泉，等. 肠上皮紧密连接蛋白mRNA的表达与仔猪断奶腹泻关系的研究[J]. 中国畜牧兽医，2014，41（9）：221-224.

[5]冯贇，郑萍. DLG5与克罗恩病相关性的研究进展[J]. 国际消化病杂志，2008，28（4）：277-279.

[6]Friedrichs F，Stoll M. Role of discs large homolog 5[J]. World Journal of Gastroenterology，2006，12（23）：3651-3656.

[7]Ye L，Su X M，Wu Z C，et al. Analysis of differential miRNA expression in the duodenum of Escherichia coli F18-sensitive and -resistant weaned piglets[J]. PLoS One，2012，7（8）：e43741.

[8]吴正常，殷学梅，孙丽，等. 猪miR-192/-215的组织表达谱及其关键靶基因分析[J]. 中国农业科学，2015，48（11）：2251-2261.

[9]叶兰，潘章源，黄雪根，等. 苏太猪抗F18+大肠杆菌病基础群FUT1基因多态性及其与生长发育的关联分析[J]. 中国畜牧兽医，2010，37（4）：158-161.

[10]张培晏，刘峻. 产肠毒素性大肠杆菌菌毛的研究进展[J]. 四川畜牧兽医，2016，43（1）：32-34.

[11]陈传荣，韩敏敏，张乃嘉，等. 腹泻仔猪源致病性大肠杆菌生物膜与耐药性及毒力的相关性[J]. 微生物学通报，2016，43（10）：2234-2241.

[12]黄盛秋，徐辉. 克罗恩病易感基因研究進展[J]. 西南军医，2013，15（2）：188-191.

[13]Shah G，Brugada R，Gonzalez O，et al. The cloning，genomic organization and tissue expression profile of the human DLG5 gene[J]. BMC Genomics，2002，3（1）：6.

[14]Stoll M，Corneliussen B，Costello C M，et al. Genetic variation in DLG5 is associated with inflammatory bowel disease[J]. Nature Genetics，2004，36（5）：476-480.