复方接骨中药介导MAPK信号通路促进骨髓间充质干细胞增殖及成骨分化

梁 军 刘安民 葛洪醒 周 峰 金 涛 罗 丹

(荆门市第二人民医院骨科，湖北 荆门 448000)

复方接骨中药介导MAPK信号通路促进骨髓间充质干细胞增殖及成骨分化

梁 军 刘安民 葛洪醒 周 峰 金 涛 罗 丹

(荆门市第二人民医院骨科，湖北 荆门 448000)

目的 探讨复方接骨中药介导MAPK信号通路对骨髓间充质干细胞(BMSCs)增殖及成骨分化的促进作用。方法 取健康雄性SD大鼠60只，随机平均分为实验组和对照组，实验组灌喂复方接骨中药煎剂，对照组灌喂等体积自来水，处理10 d后提取各组大鼠血清。分离BMSCs，利用体积分数为0.1的含药血清及非含药血清单独处理BMSCs 24、48、72 h及联合10 μmol/L p38MAPK抑制剂SB203580处理BMSCs 72 h后，MTT检测细胞增殖；RT-PCR及Western印迹检测两组血清单独处理及联合SB203580处理BMSCs 72 h后成骨细胞分化标记基因ALP、BGP、BMP-2的表达；Western印迹检测两组血清处理BMSCs 72 h p38蛋白表达及磷酸化。结果 含药血清处理24、48 h，细胞OD值与非含药血清组及对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)，第72小时含药血清组细胞OD值显著高于对照组及非含药血清组(P<0.01)，非含药血清组细胞OD值与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)。两组血清处理72 h后，含药血清处理组ALP、BGP、BMP-2表达及p38磷酸化明显高于对照组及非含药血清组(P<0.01)，非含药血清组ALP、BGP、BMP-2表达及p38磷酸化与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)，p38总蛋白表达三组差异无统计学意义(P>0.05)。SB203580联合两组血清处理72 h后，非含药血清+SB203580组与SB203580组细胞增殖及ALP、BGP、BMP-2表达差异无统计学意义(P>0.05)，明显低于对照组(P<0.01)，含药血清+SB203580组细胞增殖及ALP、BGP、BMP-2表达显著高于SB203580组(P<0.01)，与对照组差异无统计学意义(P>0.05)。结论 复方接骨中药可能通过促进MAPK信号通路促进BMSCs的增殖及成骨分化。

复方接骨中药；骨髓间充质干细胞

间充质干细胞(MSCs)是存在于发育早期中胚层和外胚层的干细胞，骨髓MSCs(BMSCs)则是存在于骨髓的MSCs〔1〕。BMSCs具有多分化潜能，在个体发育成熟及组织修复过程中发挥重要作用〔2〕。研究发现，中药许多组分体外对于BMSCs的增殖及分化具有促进作用〔3〕。本实验所用药方参照范红旗等〔4〕的药方成药，具有补肝肾、强筋骨、活血止痛等作用，对骨折愈合具有促进作用。目前复方接骨中药促进BMSCs增殖、分化的研究较少且机制不清。本研究通过中药药理学〔5〕方法获得含药血清作为药物源，体外获得BMSCs，研究复方接骨中药对BMSCs增殖及成骨分化的影响，探讨相关机制。

1 材料与方法

1.1 材料 雄性SD大鼠由武汉大学动物实验中心提供。接骨中药组方：厚朴10 g，大黄10 g，枳壳10 g，桃仁10 g，苏木10 g，当归10 g，红花5 g，骨碎补15 g，川断15 g，熟地15 g，自然铜10 g，龟板10 g，枸杞15 g，杜仲15 g。DMEM培养基、胰蛋白酶购自美国Gibco；胎牛血清购自杭州四季青生物工程有限公司；蛋白酶裂解液、青链霉素双抗购自上海碧云天生物技术有限公司；p38MAPK抑制剂SB203580购自美国Gene Operation；碱性磷酸酶(ALP)单抗、骨钙素(BGP)单抗、骨形态发生蛋白(BMP)-2单抗、p38单抗、p-p38单抗、β-actin单抗、过氧化物酶标记的二抗购自美国Santa Cruz Biotech；噻唑蓝(MTT)检测试剂盒购自上海奥迪生物制品有限公司；PrimerScript反转录试剂盒购自大连宝生物工程有限公司；酶标仪购自美国Thermo；倒置显微镜购自德国Leica。

1.2 含药血清的制备 选取60只3月龄、体重300～350 g的SD健康大鼠，随机分为对照组和实验组。复方中药每天煎制后，按2.5 ml/只的量灌喂实验组大鼠，对照组每天灌喂等量的自来水，连续灌喂10 d。末次灌喂前1 d大鼠禁食水，对大鼠进行麻醉后进行腹腔取血。大鼠腹部消毒后，打开腹腔，找到腹主动脉后进行穿刺取血，每只大鼠约取7～8 ml血，2 500 r/min离心30 min取上清。上清置于56℃水浴锅中30 min使补体失活，过滤除菌后置于4℃保存。

1.3 BMSCs的分离及鉴定 取1只3月龄健康雄性SD大鼠，处死后置于75%乙醇中消毒15 min，超净台中取出大鼠的双侧股骨和胫骨，剪掉骨两端使骨髓腔暴露出来，使用含10%胎牛血清的低糖DMEM培养基反复冲洗骨髓直至骨为白色，收集流出液到离心管中，1 000 r/min离心3 min，弃去上清液，使用5 ml含10%胎牛血清的DMEM培养基重悬沉淀，细胞悬液加到5 ml 1.073 g/ml的Percoll梯度液中，4℃、500 r/min离心30 min，取中间细胞层重悬于细胞培养液中，细胞接种于25 cm2培养瓶中，置于37℃、5%的CO2细胞培养箱中培养，待细胞融合度约达到80%时，0.25%胰酶消化后收集细胞，按1∶2接种至新鲜培养基中。取第4代细胞，胰酶消化后收集细胞，磷酸盐缓冲液(PBS)重悬，并调整细胞浓度为1×106个/ml，分别加入CD29、CD45、CD11b/c、CD90抗体置于4℃避光孵育30 min，收集细胞，PBS清洗后，向沉淀中加入0.3 ml PBS重悬，流式细胞仪检测。

1.4 MTT比色法检测BMSCs增殖 取第4代对数生长期的BMSCs，胰酶消化后收集细胞，并调整细胞浓度为2×104个/ml，以每孔200 μl接种于96孔板中，置于细胞培养箱中培养24 h后，向含药血清孔中加入体积分数为0.1含药血清的DMEM培养基，非含药血清孔加入体积分数为0.1的非含药血清的DMEM培养基，分别培养24、48、72 h，含药血清+SB203580组及非含药血清+SB203580组预先加入10 μmol/L SB203580干预1 h后弃去培养基，分别加入体积分数为0.1的非含药血清及0.1的含药血清处理72 h，SB203580组加入10 μmol/L SB203580干预1 h后加入等体积PBS处理72 h，对照组不作处理，每个梯度设置6个复孔，同时设置空白对照组，培养完成后取出细胞，加入150 μl浓度为5 mg/ml的MTT溶液，置于细胞培养箱中孵育4 h后弃去上清液，加入100 μl二甲基亚砜(DMSO)震荡培养10 min，晶体完全溶解后，酶标仪检测490 nm处吸光值。

1.5 RT-PCR检测ALP、BGP、BMP-2的表达 取处理后各组细胞，向细胞中加入1 ml Trizol，冰上静置30 min，细胞中加入200 μl氯仿，震荡15s后冰上静置3 min，离心取上清液至新离心管中，加入等体积异丙醇，震荡30 s后-20℃放置30 min，离心取沉淀，加入1 ml无水乙醇漂洗2次，待沉淀晾干后加入20 μl无酶水溶解，微量核酸仪检测RNA浓度。利用PrimerScript反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA，按照荧光定量试剂盒说明配制反应体系，置于定量PCR仪检测，并分析mRNA的相对表达水平。

1.6 Western印迹检测细胞中蛋白表达 取处理72 h的各组细胞，离心收集沉淀，加入细胞裂解液冰上孵育30 min，离心收集上清转移至新的离心管中，二喹啉甲酸(BCA)法检测蛋白浓度，制备蛋白样品，样品蛋白含量一致。配制蛋白胶，蛋白胶凝固后上样，电压80 V电泳30 min，120 V继续电泳直至溴酚蓝跑出蛋白胶。取出蛋白胶冰浴转膜，取出聚偏氟乙烯(PVDF)膜加入5%脱脂奶粉室温孵育3 h，分别加入ALP单抗、BGP单抗、BMP-2单抗、p38单抗、p-p38单抗作为一抗4℃孵育过夜，Tris盐酸缓冲液(TBST)清洗后加入二抗室温孵育1 h，TBST清洗，加入化学增强发光法(ECL)发光剂显影5 min后利用自动凝胶成像系统采集图像。

1.7 统计学方法 应用SPSS21.0软件行t检验，使用GraphPad Prism 5统计软件绘图。

2 结 果

2.1 含药血清对BMSCs增殖的影响 非含药血清组与对照组细胞OD值差异不大(P>0.05)，第24小时和第48小时含药血清组OD值与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)，72 h时含药血清组细胞OD值明显高于对照组及非含药血清组(P<0.01)。说明复方接骨中药促进BMSCs增殖。见图1。

2.2 含药血清对成骨分化的影响 mRNA表达统计时将对照组ALP、BGP、BMP-2 mRNA的表达均设为1，蛋白表达统计时设内参蛋白β-actin的表达为1。非含药血清组ALP、BGP、BMP-2的mRNA表达分别为(1.052±0.123)、(1.074±0.123)、(1.101±0.172)，含药血清组分别为(1.825±0.112)、(2.362±0.153)、(1.413±0.135);对照组ALP、BGP、BMP-2的蛋白表达分别为(0.223±0.015)、(0.329±0.021)、(0.162±0.008)，非含药血清组分别为(0.227±0.016)、(0.334±0.022)、(0.169±0.009)，含药血清组分别为(0.398±0.019)、(0.683±0.024)、(0.262±0.016)，非含药血清组ALP、BGP、BMP-2的表达与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)，含药血清组三者mRNA及蛋白的表达均明显升高，与对照组及非含药血清组相比差异有统计学意义(P<0.01)。见图2。

2.3 含药血清对p38蛋白磷酸化的影响 将内参蛋白β-actin的表达设为1。对照组p38、p-p38蛋白表达分别为(0.524±0.023)、(0.167±0.014)，非含药血清组分别为(0.527±0.025)、(0.170±0.016)，含药血清组分别为(0.529±0.026)、(0.318±0.017)，非含药血清组与对照组相比未出现显著性变化(P>0.05)，含药血清组p38总蛋白表达与对照组相比无明显变化(P>0.05)；p-p38蛋白表达明显升高，显著高于对照组及非含药血清组(P<0.01)。见图3。

2.4 p38MAPK抑制剂联合血清作用对p38蛋白表达及磷酸化的影响 设内参蛋白β-actin的表达为1，对照组p38、p-p38蛋白表达分别为(0.518±0.028)、(0.182±0.026)，SB203580组为(0.516±0.027)、(0.104±0.018)，非含药血清组+SB203580组分别为(0.520±0.029)、(0.108±0.016)，含药血清组+SB203580组分别为(0.521±0.031)、(0.175±0.014)，4组细胞中p38总蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)；非含药血清+SB203580组和SB203580组p-p38的表达未出现显著差异(P>0.05)，与对照组相比显著降低(P<0.01)，含药血清组p-p38的表达与对照组差异无统计学意义(P>0.05)，显著高于SB203580组(P<0.01)。见图4。

与对照组相比：1)P<0.01；与非含药血清组相比：2)P<0.01图1 两组血清对BMSCs增殖的影响

图2 两组血清对ALP、BGP、BMP-2表达的影响

图3 两组血清对p38蛋白表达及磷酸化的影响

2.5 p38MAPK抑制剂联合血清作用对BMSCs增殖的影响 对照组、SB203580组、非含药血清组+SB203580组、含药血清组+SB203580组OD值分别为(0.118±0.014)、(0.061±0.012)、(0.069±0.011)、(0.102±0.009)，非含药血清+SB203580组与SB203580组细胞OD值差异无统计学意义(P>0.05)，明显低于对照组(P<0.01)，含药血清+SB203580组细胞OD值显著高于SB203580组(P<0.01)，与对照组差异无统计学意义(P>0.05)。

2.6 p38MAPK抑制剂联合血清作用对成骨分化的影响 SB203580组ALP、BGP、BMP-2 的mRNA表分别为(0.428±0.032)、(0.397±0.027)、(0.221±0.018)，非含药血清组+SB203580组ALP、BGP、BMP-2 mRNA分别为(0.436±0.033)、(0.408±0.026)、(0.230±0.017)，含药血清组+SB203580组分别为(0.973±0.054)、(0.962±0.048)、(0.592±0.037)；对照组ALP、BGP、BMP-2 的蛋白表达分别为(0.322±0.021)、(0.454±0.032)、(0.215±0.020)，SB203580组分别为( 0.218±0.019)、( 0.234±0.026)、(0.112±0.015)，非含药血清组+SB203580组分别为(0.220±0.021)、(0.239±0.028)、(0.115±0.016)，含药血清组+SB203580组分别为(0.317±0.023)、(0.441±0.035)、(0.210±0.020)，非含药血清+SB203580组与SB203580组细胞ALP、BGP、BMP-2 mRNA及蛋白表达差异无统计学差异(P>0.05)，明显低于对照组(P<0.01)，含药血清+SB203580组细胞三种基因表达显著高于SB203580组(P<0.01)，与对照组差异无统计学意义(P>0.05)。见图5。

1：对照组；2：SB203580组；3：非含药血清+SB203580组；4：含药血清+SB203580组；下图同图4 p38MAPK抑制剂联合血清作用对p38蛋白表达及磷酸化的影响

图5 p38MAPK抑制剂联合血清作用对成骨分化的影响

3 讨 论

研究发现成人MBSCs仍具有分化能力，在适宜的条件下能分化成骨相关的结缔组织，证实MBSCs具有成骨能力〔6〕。ALP是成骨细胞分化所必需的酶，是成骨细胞分化的早期标志物〔7〕。ALP通过水解有机酸酯为游离的磷酸根，而且能通过破坏钙化抑制剂启动钙化的发生〔8〕。ALP的活性标志着成骨细胞的分化程度。BGP是由成熟的成骨细胞分泌的一种多肽，是成骨细胞分化的中期标志物〔9〕。BGP含量的高低与成骨细胞的分化程度正相关。大量研究证实，BGP含量增高促进成骨细胞分化。BMP-2也是成骨细胞分化的检测指标，其含量的高低与成骨细胞的分化程度密切相关〔10〕。BMP-2的表达对成骨细胞的增殖以及分化具有促进作用〔11〕。本研究结果说明复方接骨中药能促进MBSCs向成骨细胞分化。MAPK是一类丝氨酸/苏氨酸激酶，对细胞的生长、分化、炎症反应等具有调节作用〔12〕。MAPK信号通路包括ERK1/2、p38等，活化的MAPK通过级联反应将外界信号传递给细胞核，通过作用于AIF-2、c-Myc等转录因子，调节与细胞增殖、分化相关的基因表达〔13〕。有报道称p38MAPK信号通路对成骨细胞的分化具有促进作用，p38蛋白的磷酸化是该通路被激活的重要过程〔14〕。本研究结果显示，复方接骨中药血清对p38的磷酸化具有促进作用，提示该中药可能通过活化p38MAPK信号通路促进MBSCs的增殖及成骨分化。蛋白酶抑制剂具有抑制蛋白激酶活性的能力，SB203580是p38MAPK的常用抑制剂，能够透过细胞抑制p38蛋白磷酸化，进而抑制后续的级联反应，研究发现SB203580可以有效抑制细胞中一些炎症因子诱导的信号转导途径〔15〕。本研究证实复方接骨中药通过作用于p38MAPK信号通路，使p38蛋白磷酸化增强，进而促进该信号通路的活化，促进MBSCs的增殖及成骨分化。

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〔2016-10-24修回〕

(编辑 袁左鸣)

湖北省自然科学基金项目(No.2004ABA208)

罗 丹(1978-)，女，副主任医师，主要从事骨疾病研究。

梁 军(1969-)，男，副主任医师，主要从事骨疾病研究。

R681

A

1005-9202(2017)10-2360-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.10.007