EphA3促进胃癌细胞BGC823的增殖

吕晓业，王健，李昕宇，黄芳，王芃，周建光，李山虎，卫勃

1.解放军总医院 普外科，北京 100853；2.军事医学科学院 生物工程研究所，北京 100850；

3.湖北医药学院 生物医学工程学院，湖北 十堰 442000；

EphA3促进胃癌细胞BGC823的增殖

吕晓业1，王健2，李昕宇3，黄芳2，王芃2，周建光2，李山虎2，卫勃1

1.解放军总医院 普外科，北京 100853；2.军事医学科学院 生物工程研究所，北京 100850；

3.湖北医药学院 生物医学工程学院，湖北 十堰 442000；

目的：初步探索EphA3与胃癌细胞BGC823增殖的关系。方法：用T4DNA连接酶将EphA3的全长cDNA片段连接到酶切后的慢病毒载体pCDH-EF1-MCS-T2A-Puro中制备慢病毒，感染胃癌BGC823细胞建立过表达EphA3细胞系，Western印迹检测目的蛋白的表达，CCK8细胞生长实验和裸鼠成瘤实验检测EphA3对BGC823细胞增殖的影响。结果：双酶切鉴定与基因测序表明过表达EphA3慢病毒载体构建成功；Western印迹表明建立了过表达EphA3的BGC823细胞系，高表达EphA3对BGC823细胞的增殖和成瘤后生长有明显的促进作用。结论：EphA3促进BGC823胃癌细胞增殖，为胃癌的靶向性治疗及个性化治疗提供了线索。

EphA3；胃癌；BGC823细胞

胃癌是全球范围内最常见的肿瘤之一，其致死率排在各种癌症的第2位，且5年平均生存率不足30%[1-2]。胃癌目前仍难以治愈，主要原因是大多数病人确诊时已处于晚期或发生了转移，术后往往因复发而导致死亡，因而需要进一步探索更加有效的治疗方法[3]。目前分子靶向性治疗日益受到研究者的重视，其中受体酪氨酸激酶家族中的Eph分子在胃癌发生发展中的作用及其作为治疗靶点的前景逐渐受到关注。根据其序列的相似性及结合特异性，受体Ephs分子与配体Ephrins分子可分为A和B两类[4-5]。研究发现Ephs和Ephrins经常在肿瘤细胞与组织中表达失调，且在不同类型肿瘤中Ephs具有促进肿瘤形成或抑制肿瘤发生的功能[6-7]。EphA3最早由Boyd发现，是首个被克隆的Eph受体家族分子，其鉴定与分离过程提示EphA3可能与其家族中其他受体分子一样，在肿瘤的发生发展中发挥功能[8]。我们探讨了过表达EphA3对胃癌细胞增殖的影响，期盼为胃癌的靶向性治疗提供相关研究基础。

1 材料与方法

1.1 材料

BALB/c-裸鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司；293T和BGC823细胞为本实验室保存；慢病毒载体pCDH-EF1-MCS-T2A-Puro为金蕊博士惠赠；包装载体psPAX2和pMD2.G购自Addgene公司；DMEM培养基、胰酶购自Gibco公司；T4DNA连接酶、BamHⅠ和NotⅠ限制性内切酶购自TaKaRa公司；质粒提取试剂盒、PCR回收试剂盒及胶回收试剂盒购自康宁生命科技有限公司；胎牛血清购自杭州四季青公司；γ-Tubulin、p-AKT、AKT、ERK1/2、p-ERK1/2和EphA3抗体购自Cell Signaling公司；辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠、山羊抗兔IgG抗体购自中杉金桥公司；转染试剂PEI为本实验室保存；Cell Counting Kit 8试剂盒购自东仁化学科技有限公司。

1.2 细胞培养

在37℃、5%的CO2孵箱中，用含10%胎牛血清、1%双抗（50 U/mL氨苄西林、100 U/mL链霉素）的DMEM培养基培养293T和BGC823细胞。

1.3 过表达EphA3的慢病毒表达载体的构建与鉴定

根据基因序列设计扩增EphA3全长cDNA的上、下游引物EphA3-F（5'-ACGGATCCATGGATT GTCAGCTCTCCATC-3'）和EphA3-R（5'-GCGCGG CCGCCACGGGAACTGGGCCATTC-3'），以本室保存的pCDNA-EphA3为模板，PCR扩增得到EphA3的cDNA全长，用BamHⅠ和NotⅠ酶切后连接到慢病毒载体pCDH-EF1-MCS-T2A-Puro上，转化到大肠杆菌DH5α感受态中扩增，挑取克隆，用含氨苄西林的LB培养液振荡培养后提取质粒，经BamHⅠ和NotⅠ双酶切鉴定，阳性克隆测序。

1.4 慢病毒载体的包装

转染前1 d将293T细胞接种至10 cm细胞培养皿中，接种量控制在60%～70%，转染前2 h更换新鲜的DMEM培养液。按转染试剂说明书将慢病毒包装质粒psPAX2、包膜质粒pMD2.G和过表达EphA3慢病毒质粒pCDH-EF1-EphA3-T2APuro按3∶1∶2的比例和转染试剂PEI分别用DMEM按1μg∶1μL的比例稀释，静置5 min后混合，再次静置30 min后滴入293T细胞，用同样方法转染对照质粒，12 h后更换新鲜的DMEM培养液，48 h后收取病毒上清过滤，将分装后的病毒液放置于-80℃保存。

1.5 病毒感染BGC823细胞

感染前1 d将BGC823细胞接种到10 cm细胞培养皿中，接种量控制在60%～70%，感染时将5 mL病毒上清、5 mL培养液和10μL浓度为10 ng/mL的聚凝胺（polybrene）混匀后滴入BGC823细胞，12 h后更换培养液，48 h用嘌呤霉素筛选获得稳定过表达EphA3的细胞。

1.6 Western印迹检测

收集蛋白样品并加入5×SDS缓存液，煮沸10 min后行SDS-PAGE，再湿转至醋酸纤维膜上，用5%BSA室温封闭30 min，4℃孵育稀释的一抗摇床过夜，用TBST洗膜液洗膜3次，每次7 min，室温孵育稀释的二抗6 h，之后用TBST洗膜3次，每次7 min，滴加发光液后在暗室显影、定影。

1.7 CCK8细胞增殖实验

将过表达EphA3的BGC823和对照细胞接种至96孔板中，接种密度为1000/孔，重复3次，在不同时间加入Cell Counting Kit 8试剂，37℃静置2 h后用酶标仪检测D450nm值，绘制生长曲线。

1.8 裸鼠成瘤实验

将5×106个处于对数生长期过表达EphA3的BGC823细胞和对照细胞悬浮于200μL无血清的RPMI-1640培养液中，分别接种于6～8周的BALB/ c雌鼠背部皮下，肿瘤形成后每隔1 d测量肿瘤的大小，计算肿瘤体积（长×宽×高×0.526）。

2 结果

2.1 过表达EphA3慢病毒的构建、鉴定

PCR扩增得到EphA3全长cDNA序列，将其克隆连接到慢病毒表达载体pCDH-EF1-MCS-T2APuro上，挑选单克隆提取质粒后用BamHⅠ和NotⅠ双酶切鉴定（图1），得到约2.9 kb的片段，送公司测序，测序结果表明EphA3成功插入pCDHEF1-EphA3-T2A-Puro表达载体的BamHⅠ和NotⅠ酶切位点之间。

2.2 Western印迹检测感染慢病毒后BGC823细胞中EphA3蛋白的水平

为了建立过表达EphA3的BGC823细胞系，通过慢病毒包装系统和pCDH-EF1-EphA3-T2A-Puro共转染293T细胞获得了含有EphA3表达载体的慢病毒颗粒，用病毒感染BGC823细胞并经嘌呤霉素筛选后得到稳定感染的细胞系。Western印迹检测发现EphA3蛋白表达水平显著升高，说明EphA3慢病毒载体有效促进了细胞中EphA3蛋白的表达（图2）。另外还分析了过表达EphA3后细胞中2个重要的信号通路的活性，发现EphA3过表达没有影响AKT激酶的活性，但显著激活了ERK激酶的磷酸化水平，提示我们EphA3可能在促进肿瘤的增殖上发挥重要作用。

图1 表达EphA3质粒的BamHⅠ和NotⅠ双酶切鉴定

2.3 生长曲线检测过表达EphA3对BGC823细胞增殖的影响

为了探索EphA3对BGC823细胞增殖的调控作用，用Cell Counting Kit 8试剂盒检测过表达EphA3后对BGC823细胞生长的影响。与对照组相比，过表达EphA3的BGC823细胞生长明显加快，说明在BGC823细胞中EphA3蛋白发挥促进细胞生长增殖的作用（图3）。

2.4 体内试验检测过表达EphA3对肿瘤生长的促进作用

为了了解EphA3在体内对肿瘤增长的影响，将BGC823细胞与EphA3过表达后的BGC823细胞分别接种至裸鼠皮下，各重复3只，观察肿瘤生长状况。与对照组相比，过表达EphA3的BGC823细胞在裸鼠体内形成的肿瘤明显大于对照组，说明EphA3能够促进小鼠体内肿瘤生长（图4）。

图2 Western印迹检测慢病毒感染后BGC823细胞EphA3蛋白表达

图3 过表达EphA3对BGC823细胞增殖的影响

图4 裸鼠成瘤试验中，过表达EphA3能明显促进肿瘤生长

3 讨论

胃癌的发生发展是在环境因素与遗传因子复杂的相互作用下导致的一个多步骤过程。大量研究证明胃癌与一些重要的癌基因、抑癌基因、DNA修复基因及细胞黏附分子的遗传学或表观遗传学改变有关，但对这些改变与胃癌的发生发展及预后关系的了解仍然有限[9-10]。深入研究胃癌相关基因的生物学功能，将为了解胃癌的发病机制、诊断和选择靶向性治疗策略提供新的线索。研究发现EphA3往往在正常组织中限制性表达或低表达，在肿瘤组织中高表达或发生突变，可能参与肿瘤的增殖、迁移和血管形成等功能[11-12]。EphA3在胃癌发生发展中是否具有重要作用，相关研究并不深入。Xi等报道EphA3在胃癌肿瘤组织中高表达，且与肿瘤大小、组织分化、侵袭与转移能力等有关，还发现EphA3的表达和血管内皮生长因子及微血管密度的表达水平正相关，提示我们EphA3的功能可能和肿瘤中的血管形成有关[13]。在此基础上，我们建立了高表达EphA3的胃癌细胞系，初步研究结果发现EphA3在BGC823细胞中的表达改变能够调控肿瘤细胞在体内外的增殖能力。我们的研究还表明EphA3参与调控细胞中的重要信号通路，如MAPK/ERK信号通路的活性，而该信号途径往往在肿瘤增殖、侵袭和转移过程中起重要作用。这一研究结果为我们了解EphA3在胃癌中发挥功能的分子机制，以及胃癌病人的分子靶向性治疗及个性化治疗方案提供了有益的基础。

[1]Parkin D M,Bray F,Ferlay J,et al.Global cancer statistics,2002[J].CA Cancer J Clin,2005,55:74-108.

[2]Ferlay J,Shin H R,Bray F,et al.Estimates of worldwide burden of cancer in 2008:GLOBOCAN 2008[J]. Int J Cancer,2010,127:2893-2917.

[3]Cunningham D,Starling N,Rao S,et al.Upper Gastrointestinal Clinical Studies Group of the National Cancer Research Institute of the United Kingdom: Capecitabine and oxaliplatin for advanced esophagogastriccancer[J].N Engl JMed,2008,358:36-46.

[4]Pasquale E B.Eph receptors and ephrins in cancer: bidirectional signaling and beyond[J].Nat Rev Cancer, 2010,10:165-180.

[5]Noren N K,Foos G,Hauser C A,et al.The EphB4 receptor suppresses breast cancer cell tumorigenicity through an Abl-Crk pathway[J].Nat Cell Biol,2006, 8:815-825.

[6]Genander M,Halford M M,Xu N J,et al.Dissociation of EphB2 signaling pathways mediating progenitor cell proliferation and tumor suppression[J].Cell,2009, 139:679-692.

[7]Meza-Junco J,Au H J,Sawyer M B.Trastuzumab for gastric cancer[J].Expert Opin Biol Ther,2009,9:1543-1551.

[8]Boyd A W,Ward L D,Wicks I P,et al.Isolation and characterization of a novel receptor-type protein tyrosine kinase(hek)from a human pre-B cell line[J]. J Biol Chem,1992,267:3262-3267.

[9]McLean M H,El-Omar E M.Genetics of gastric cancer[J].Nat Rev Gastroenterol Hepatol,2014,11:664-674.

[10]Yamamoto H,Watanabe Y,Maehata T,et al.An updated review of gastric cancer in the next-generation sequencing era:insights from bench to bedside and vice versa[J].World J Gastroentero,2014,20:3927-3937.

[11]Wu Q,Suo Z,Risberg B,Karlsson M G,et al.Expression of Ephb2 and Ephb4 in breast carcinoma[J]. Pathol Oncol Res,2004,10:26-33.

[12]Ireton R C,Chen J.EphA2 receptor tyrosine kinase as a promising target for cancer therapeutics[J].Curr Cancer Drug Targets,2005,5:149-157.

[13]Xi H Q,Wu X S,Wei B,et al.Aberrant expression of EphA3 in gastric carcinoma:correlation with tumor angiogenesis and survival[J].J Gastroenterol,2012,47: 785-794.

EphA3 Promotes the Proliferation of Gastric Cancer Cell BGC823

LYU Xiao-Ye1,WANG Jian2,LI Xin-Yu3,HUANG Fang2,
WANG Peng2,ZHOU Jian-Guang2,LI Shan-Hu2*,Wei Bo1*

1.General Hospital of Chinese PLA,Beijing 100853;2.Beijing Institute of Biotechnology,Beijing 100850;
3.School of Biomedical Engineering,Hubei University of Medicine,Shiyan 442000;China

*Co-corresponding authors,WEI Bo,E-mail:weibo@vip.163.com;LI Shan-Hu,E-mail:lishanhu6@163.com

Objective:To explore the function of EphA3 on cell proliferation in BGC823 cells.Methods:T4DNA ligase was used to ligate exogenous cDNA fragment of EphA3 into the pCDH-EF1-MCS-T2A-Puro vector. The recombinant plasmid with lentivirus packaging plasmids was transfected into 293T cells lines and lentiviral particles were collected at different time.BGC823 cells were infected with lentiviral particles and expression of EphA3 was verified by Western blotting.Moreover,CCK8 test and xenograft assay in nude mice were used to examine the proliferation of the infected BGC823 cells with EphA3 overexpression.Results:Double enzyme digestion and gene sequencing proved that the construction of plasmid was successful.The lentiviral plasmid can upregulate the EphA3 protein level in BGC823 cells.EphA3 overexpression promotes gastric cancer BGC823 cells proliferationin vitroandin vivo.Conclusion:In BGC823 cells,EphA3 overexpression can promote tumor cell proliferation,and perhaps play an important role in gastric cancer development.

EphA3;gastric cancer;BGC823 cells

Q78;Q25

A

1009-0002（2017）03-0286-04

10.3969/j.issn.1009-0002.2017.03.009

2017-02-17

国家自然科学基金（81372140，81372770，81470138）

吕晓业（1987-），男，硕士研究生；王健，（1971-），男，博士。两者为共同第一作者

卫勃，（E-mail）weibo@vip.163.com；李山虎，（E-mail）lishanhu6@163.com