高效液相色谱法检测运动食品中的纳他霉素

王亚君

（河南财政金融学院，河南郑州450046）

高效液相色谱法检测运动食品中的纳他霉素

王亚君

（河南财政金融学院，河南郑州450046）

建立一种快速、有效的高效液相色谱法测定运动食品中纳他霉素残留的方法。样品经甲醇提取后，采用HLB固相萃取小柱进行净化和富集。采用Waters RP C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）分离，以甲醇∶水∶乙酸（体积比）= 60∶35∶5作为流动相，用PDA检测器检测，外标法峰面积定量。结果表明，纳他霉素标准在0.50μg/mL～10.00μg/mL浓度范围内线性良好，相关系数r2为0.9999，检出限为10.0μg/kg，定量限为30.0μg/kg，加标回收率达到84.6%～90.5%。该方法具有前处理简单、净化效果好、灵敏度高和检测速度快的优点，适用于运动食品中纳他霉素残留的分离和定量检测。

固相萃取；高效液相色谱；纳他霉素

纳他霉素（Natamycin）是一种由链霉菌发酵产生的天然抗真菌化合物，属于多烯大环内酯类，结构式如图1所示。纳他霉素既可以广泛有效的抑制各种霉菌、酵母菌的生长，又能抑制真菌毒素的产生，可广泛用于食品防腐保鲜以及抗真菌治疗。运动食品又称运动营养食品，是与运动相关的一类功能食品。此类食品定义为：能够为运动者提供特殊营养需求，调整代谢状态，并有助于提高体能和体质的食品。在各种运动食品中由于营养丰富，有的含糖量、有机酸的含量较高，很适合酵母菌的生长繁殖，引起食品的腐败变质，使用纳他霉素可以增加运动食品的贮存稳定性。1996年，中国食品添加剂标准化学技术委员会正式批准纳他霉素可作为食品防腐剂。FAO/WHO联合食品添加剂专家委员会规定了人体可无条件接受每天摄入每公斤体重0.3 mg的纳他霉素。我国国标GB 2760-2014《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》[1]规定了纳他霉素的在各类食品中最大使用量和残留量。

图1 纳他霉素的结构图Fig.1Structure of natamycin

目前测定食品中的纳他霉素方法主要有滴定法[2]、薄层分析法[2]、微生物法[3]、分光光度计法[4-5]、高效液相色谱法[6-10]以及高效液相色谱-串联质谱法[11]等。滴定法和分光光度计法较为简单，但是不能排除实际样品中基质干扰的影响，难以精确定量；薄层分析法主要用于定性分析，难以精确定量；微生物法适用于溶液、物质浸出物或生物材料中纳他霉素的测定，但其检测周期长，且选择性较差，使其应用受到了限制；液相色谱-串联质谱法检测精度高，但由于仪器价格昂贵难以普及，液相色谱法是目前食品中纳他霉素残留检测中使用最多的方法，也能够基本满足检测要求。本实验采用固相萃取-高效液相色谱法（PDA）测定运动食品中的纳他霉素，不仅可以满足一般食品中纳他霉素含量的检测要求，而且可以针对食品中微量的纳他霉素起到一个富集净化的作用，从而达到检测的目的，这一点非常适合运动食品这一类要求比较特殊的食品。本试验对运动食品的样品前提取条件、固相萃取条件、仪器条件进行优化，经验证本试验方法灵敏度高，准确性好，是一种简便、快速、准确的检测方法。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

2695型高效液相色谱系统、2998型PDA检测器：Waters；RV10旋转蒸发仪：IKA。

纳他霉素标准品：购于国家标准物质中心；甲醇、乙腈为色谱纯。

HLB固相萃取小柱：规格3cc，250 mg。

1.2 样品来源

样品均为市场上销售的各类运动食品。

1.3 色谱条件

色谱柱：Waters RP C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流速：1.0 mL/min；进样量：20 μL。

柱温：30℃；

1.4 试验方法

1.4.1 流动相体系的选择

固定流动相流速1.0 mL/min，配制不同体系的流动相，流动相Ⅰ为甲醇∶水∶乙酸（体积比）=60∶35∶5；流动相Ⅱ为甲醇∶水（体积比）=60∶40；流动相Ⅲ为甲醇∶乙酸铵溶液（体积比）=60∶40，考察了流动相对纳他霉素色谱行为的影响。

1.4.2 检测波长的选择

本试验采用PDA检测器进行全波长扫描（扫描范围200 nm～400 nm），根据纳他霉素标准品的响应值，选择比较合适的检测波长。

1.4.3 标准曲线的制作

称取相应质量的纳他霉素标准品，配制成浓度为0.50、1.00、2.00、4.00、8.00、10.00 μg/mL的标准溶液，进行仪器分析，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线。

1.4.4 样品前处理条件的优化

运动食品中除了蛋白质、脂肪、糖分等固有的食品基质外，还含有很多的人为添加的营养元素，成分复杂，对前处理要求高，所以本试验采用固相萃取技术，使用固相萃取小柱对纳他霉素残留起到一个净化和富集的作用，并且对样品的提取条件进行优化，综合选出一个优化的前处理方法。

1.4.5 加标回收实验及样品测定

以市售未添加纳他霉素的运动食品为空白基质，加入标准溶液，选择优化后的前处理条件操作，过固相萃取柱，上机检测，计算回收率。

2 结果与讨论

2.1 流动相体系的选择

参考相关标准和文献[6-11]，发现不同标准和文献检测纳他霉素残留的流动相体系不同，主要分为3大类流动相体系：甲醇-水-乙酸溶液体系、甲醇/水体系和甲醇/乙酸铵溶液体系。所以为了了解这些流动相对纳他霉素色谱行为的影响，固定流动相洗脱速度，配制不同体系的流动相[Ⅰ：甲醇∶水∶乙酸（体积比）=60∶35∶5；流动相Ⅱ：甲醇∶水（体积比）=60∶40；流动相Ⅲ：甲醇∶乙酸铵溶液（体积比）=60∶40]，考察了流动相对纳他霉素色谱行为的影响。

结果表明：在3种流动相体系中，均对纳他霉素的色谱保留行为有不同程度的影响，其中流动相[Ⅰ：甲醇∶水∶乙酸（体积比）=60∶35∶5]的分离度最好，如图2所示，在RP C18柱上可得到良好的基线分离，其峰型良好，出峰时间合适。

2.2 检测波长的选择

本试验采用PDA检测器对纳他霉素进行全波长扫描（扫描范围200 nm～400 nm）见图3。

如图3所示，纳他霉素在302 nm和318 nm附近各存在一个吸收峰。纳他霉素标液在上述两个特征波长条件下的色谱图对比显示，302 m波长条件下检测的响应值更高一点，峰形较好且峰形相近，所以选择302 nm作为纳他霉素的检测波长。

图2 纳他霉素的色谱图Fig.2The chromatogram of natamycin

图3 纳他霉素的全波长扫描图Fig.3Full wavelength scanning chart of natamycin

2.3 标准曲线的制作

为了验证纳他霉素在流动相Ⅰ[甲醇∶水∶乙酸（体积比）=60∶35∶5]体系中的线性关系，配制了浓度为0.50、1.00、2.00、4.00、8.00、10.00 μg/mL的系列标准溶液。试验结果表明，纳他霉素在0.50 μg/mL～10.00 μg/mL内均具有良好的线性关系（r2＞0.99）；采用在空白基质中添加目标组分的方法，依据色谱峰的信噪比（S/N）大于3倍确定检出限（LOD），S/N大于10倍确定定量限（LOQ），得到纳他霉素组分的LOD为10.0 μg/kg，LOQ为30.0 μg/kg，结果见表1。

表1 纳他霉素的保留时间、标准曲线、相关系数、检出限与定量限Table 1Retention time，standard curve，correlation coefficient，detection limit and quantitative limit of natamycin

2.4 提取溶剂的选择

根据纳他霉素的化学特性，其在水中的溶解度很低（约40 mg/L），在甲醇中的溶解度较高（1 200 mg/L）。参考GB/T 21915-2008《食品中纳他霉素的测定液相色谱法》中方法，用甲醇-水溶液（30∶10，体积比）提取，但是在实际操作时，容易发生乳化现象，离心后提取溶液仍然不分层。因此试验以甲醇为提取剂，由于蛋白质在甲醇中会变性而沉淀，脂肪在冷冻条件下会析出，再进行冷冻离心，能较好地提取纳他霉素，去除干扰组分的影响。

2.5 固相萃取淋洗液、洗脱液的条件优化

固相萃取法集样品提取、浓缩、净化于一体，简化了操作步骤，减少了溶剂用量，提高了样品前处理效率而受到重视。本试验中利用固相萃取柱主要进行淋洗和洗脱两步骤，淋洗液的主要作用就是将吸附在固相萃取HLB小柱上样品杂质给洗掉，一般有用甲醇-水、氨化甲醇、氨水溶液、水这4种淋洗方式，分别对这4种的淋洗效果进行比较；洗脱液常用的有酸化甲醇和甲醇两种洗脱溶剂，结果以纳他霉素的回收率为比较依据。

结果显示；氨水溶液作为淋洗液效果最好；酸化甲醇的洗脱效果要优于甲醇，净化后杂质干扰较少，颜色比较浅，回收率能满足分析测定的需求。

2.6 加标回收与相对偏差

在以上试验的优化条件下，利用空白基质的运动食品样品进行加标回收率试验，在分别添加2、4、8μg/mL 3个梯度浓度的标准混合溶液，每个浓度平行测定5次，测定结果见表2。

由表2可见，纳他霉素的加标回收率为84.6%～90.5%，相对标准偏差（RSD）为1.6%～2.0%，表明本试验所建立的方法具有可靠的准确度和精密度。

表2 方法的回收率及相对标准偏差（n=5）Table 2Recoveries and relative standard deviations（RSD）of the method（n=5）

2.7 实际样品的测定

应用本文所建立的方法，对市售不同类型运动食品共40个批次进行测定，共发现2个批次样品含有纳他霉素。如图4所示，是一款运动食品中纳他霉素的色谱图。

图4 样品中纳他霉素的色谱图Fig.4The chromatogram of natamycin in the sample

3 结论

本文建立了一种固相萃取-高效液相色谱检测运动食品中纳他霉素残留的分析方法。结果表明，在流动相甲醇∶水∶乙酸（体积比）=60∶35∶5体系中，纳他霉素能得到良好的基线分离，其峰型良好，出峰时间合适。在302 nm的检测波长下，样品经过甲醇提取后，再处理采用HLB固相萃取柱法可有效去除样品中的复杂基质，可实现对目标物的净化与富集，能准确快速有效地检测运动食品中的纳他霉素的残留。

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[3]王志强,胡国媛.微生物抑制法快速检测鲜奶中多种抗生素残留[J].中国食品卫生杂志,2008,20(2)：139-141

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[5]周玉虎,常硕.超声萃取-紫外分光光度法测定酸奶中的纳他霉素[J].食品安全检测,2009,28(7)：78-79

[6]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局,中国国家标准化管理委员会．GB/T 21915-2008食品中纳他霉素的测定液相色谱法[S]．北京：中国标准出版社,2008

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Determination of Natamycin in Sports Food by HPLC

WANG Ya-jun
（Henan Institute of Finance and Banking，Zhengzhou 450046，Henan，China）

A rapid and effective method was established for the determination of natamycin in sports food by HPLC.After the sample was extracted by methanol，it was concentrated and purified by HLB solid phase extraction column.The separation of target compound was performed on a Waters RP C18 chromatographic column（4.6 mm×250 mm，5 μm）using methanol∶water∶acetic acid（60∶35∶5）as mobile phase，with PDA detector and external standard method peak area quantification.The linear range of natamycin was in the range of 0.50 μg/mL-10.00 μg/mL with a correlation coefficient of 0.999 9.The detection limit was 10 μg/kg and the quantitative limit was 30.0 μg/kg.The recovery rate was 84.6%-90.5%.The method has the advantages of simple pretreatment，good purifying effect，high sensitivity and fast detection rate.It is suitable for the separation and quantitative detection of natamycin in sports food.

solid phase extration（SPE）；high performance liquid chromatography（HPLC）；natamycin

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.09.037

2016-09-01

王亚君（1981—），女（汉），讲师，硕士，研究方向：体育教育训练学。