羊肚菌发酵豆渣生产多糖及其功能性的研究

姚珩，朱慧，陈野，李书红

（天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津300457）

羊肚菌发酵豆渣生产多糖及其功能性的研究

姚珩，朱慧，陈野，李书红*

（天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津300457）

以豆渣为培养基，利用羊肚菌进行半固体发酵，通过正交试验优化发酵条件，得到最佳的发酵条件为料液比1∶9（g/mL），接种量3.0%，发酵时间9 d，发酵产物中多糖（CMP，Crude Morchella Polysaccharide）含量达到8.86%。同时，对CMP的功能性进行评价，结合胆酸盐能力试验表明，CMP对3种胆酸盐（无水胆酸盐、脱氧胆酸盐、牛磺胆酸盐）均有结合效果，其中对脱氧胆酸钠的结合量最高，为（0.16±0.02）mmol/L，证明CMP有降血脂功能。体外抗氧化试验表明，CMP在浓度为10mg/mL时对羟自由基的清除能力达98.9%，显示其具有良好的抗氧化性。

羊肚菌；半固体发酵；多糖；功能性

豆渣是豆腐和豆奶加工过程中的副产品，是一种廉价的可利用资源，具有营养价值高，质地疏松，来源广泛等优点，是微生物发酵良好的培养基。目前，豆渣常用作家畜饲料、肥料或直接倒掉[1]。

近年来，菌类植物作为功能性食品和医药材料而引得人们关注[2]，现代医学研究表明多糖是其重要的活性物质之一，子实体、人工培养的菌丝体或发酵后培养基中的多糖都具有潜在的抗疲劳、抗肿瘤、抗病毒及提高机体免疫力等作用[3-4]。羊肚菌因营养价值和药用价值而受到人们喜爱，是极为珍稀的食药两用真菌，但资源稀少、培育困难。而发酵是工业化、集约化生产的重要途径，经发酵、提取后获得的多糖可作为开发功能性食品的原料[5]。

为了减少多糖生产的成本和豆渣造成的污染，本文以豆渣为培养基，利用羊肚菌进行发酵。针对固体发酵的培养时间较长，而且在较致密的环境下发酵，其代谢热的移除常造成问题，尤其是大量生产时，限制其大规模的产能，采用半固体发酵方式，运用正交试验设计优化发酵条件，从而提高多糖产量。从体外抗菌活性、结合胆酸盐能力和体外抗氧化性3个方面，对提取的多糖（CMP）进行功能性评价。

1 材料与方法

1.1 材料

豆渣：天津市山海关豆制品有限公司；羊肚菌（ACCC 50764）：中国农业微生物菌种保藏管理中心；大肠杆菌、沙门氏菌：天津科技大学微生物实验室；发酵基础培养基[6]（以5 g豆渣粉计）：葡萄糖0.2 g、（NH4）2SO40.007 5 g、MgSO4·7H2O 0.01 g；葡萄糖、磷酸二氢钾、硫酸镁、浓硫酸、无水乙醇：分析纯。

1.2 主要设备

XFS-280M手提式压力蒸汽灭菌锅：浙江新丰医疗器械有限公司；ZHWY-2102C双层小容量全温度恒温培养振荡器：上海智城分析仪器制造有限公司；TDL-5-A离心机：上海安亭科学仪器厂；756PC紫外可见分光光度计：天津普瑞斯仪器有限公司；MB23水分测定仪：奥豪斯仪器（常州）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 半固体发酵试验

1.3.1.1 豆渣的预处理

将豆渣（水分约7%）在50℃干燥后进行粉碎，过60目筛网后得到豆渣粉，置于4℃冰箱中备用。

将发酵基础培养基装入250 mL三角瓶中，以不同料液比加入蒸馏水，包扎封口，121℃灭菌30 min。待冷却至室温后以无菌操作接种羊肚菌种子培养液，25℃、120 r/min条件下，置于振荡器中培养。

1.3.1.2 半固体发酵单因素试验

选取不同的培养基料液比[1∶7、1∶9、1∶11、1∶13、1∶15（g/mL）]、接种量（1%、1.5%、2%、2.5%、3%）和发酵时间（5、6、7、8、9 d），以水提醇沉法得到的多糖含量为标准进行单因素试验[7]。

1.3.1.3 半固体发酵优化的正交试验

在单因素试验结果的基础上，进行三因素三水平正交优化试验，以获得最佳发酵条件和最大多糖含量。

1.3.1.4 多糖含量的测定

多糖含量测定采用苯酚硫酸法，标准曲线的绘制按GB/T 15672-2009《食用菌中总糖含量的测定》中葡萄糖标准曲线的绘制[8]。

样品预处理：发酵完成后，将发酵物置于50℃烘箱中干燥24 h后，进行粉碎，过60目筛网后得到发酵物干粉。

样品多糖含量的测定：准确称取样品0.5 g于烧杯中，按料水比1∶20 g/mL，置于70℃下水提90 min，4 000 r/min离心20 min，上清液过0.45 μm水系滤膜。取1 mL上清液，加入4倍体积无水乙醇，4℃下放置12 h。4 000 r/min离心20 min，取沉淀，溶于10 mL蒸馏水，制得样液。将样液稀释10倍，取1 mL稀释液，加入6%苯酚（现配）1.0 mL和浓硫酸5.0 mL，混匀后室温下静置20 min，在490 nm波长处测定吸光度值。

1.3.2 多糖的提取

预处理：将发酵物干粉用滤纸包好，放于石油醚中浸泡，直至无黄色油脂析出，50℃烘干。取脱脂后的发酵物干粉用95%乙醇于60℃浸泡1 h后离心15 min，转速3 000 r/min，以除去单糖、双糖、低聚糖等的干扰，50℃烘干[9]。多糖的提取工艺见图1。

图1 多糖的提取工艺Fig.1Polysaccharide extraction

1.3.3 结合胆酸盐能力评价

1.3.3.1 胆酸盐标准曲线的制备

分别精确称取无水胆酸钠、脱氧胆酸钠、牛黄胆酸钠3种标准品，用生理盐水配制成3种1 mmol/L的标准使用液。

取标准使用液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，分别置于具塞试管中，加生理盐水至1 mL，再加入7.5 mL质量分数60%的硫酸溶液，70℃水浴20 min，取出立即冰浴5 min，在387 nm波长处测定吸光度值。以吸光度值为纵坐标，标准使用液浓度为横坐标，绘制标准曲线[10]。

1.3.3.2 CMP结合胆酸盐能力评价

用生理盐水配制样液，浓度为3 mg/mL。取1 mL的样液于具塞试管中，加入0.01 mol/L盐酸溶液1 mL，37℃振荡消化1 h，用0.1 mol/L NaOH调节pH至6.3，再加入10 mg/mL胰酶4 mL，37℃振荡消化1 h之后，即得到经胃肠模拟环境处理的消化液。取1 mL消化液，加入1mmol/L胆酸盐溶液4 mL，37℃振荡2 h，4 000 r/min离心20 min。取1 mL上清液，加入7.5 mL质量分数60%的硫酸溶液，70℃水浴20 min，取出立即冰浴5 min，在387 nm波长处测定吸光度值。由标准曲线可得到样液中结合的胆酸盐含量[11]。

1.3.4 体外抗氧化性评价

1.3.4.1 DPPH自由基清除率评价

取0.5 mL浓度分别为0.5、1、1.5、2、2.5、3、5、10 g/mL的样液，加入0.025 mg/mL的DPPH乙醇溶液2 mL，充分摇匀后室温避光放置30 min，然后在517 nm波长处测定吸光度值，抗坏血酸（VC）作阳性对照[6]。DPPH自由基清除率计算公式如式（1）。

式中：A0为用蒸馏水代替样品测得的吸光度值；A1为样品测得的吸光度值；A2为用蒸馏水代替DPPH乙醇溶液测得的吸光度值。

1.3.4.2 羟自由基清除率评价

取1.0 mL浓度分别为0.5、1、1.5、2、2.5、3、5、10 g/mL的样液置于比色管中，依次加入20 mmol/L的水杨酸-乙醇溶液0.15 mL，1.5 mmol/L的FeSO4溶液0.5 mL，6 mmol/L的H2O2溶液0.35 mL，混匀后在37℃下水浴1h，然后在562nm波长处测定吸光度值，抗坏血酸（VC）作阳性对照[12]。羟自由基清除率计算公式如式（2）。

式中：A0为用蒸馏水代替样品测得的吸光度值；A1为样品测得的吸光度值；A2为用蒸馏水代替水杨酸-乙醇溶液测得的吸光度值。

2 结果与讨论

2.1 单因素试验

根据单因素试验结果，即培养基料液比1∶9（g/mL），接种量2.5%，发酵时间8 d，分别选择料液比1∶8、1∶9、1∶10（g/mL），接种量2.0%、2.5%、3.0%，发酵时间7、8、9 d为影响因素和水平，以水提醇沉法得到的多糖含量为标准，选取L9（34）正交表设计正交试验。表1为正交试验影响因素水平表。

表1 因素水平表Table 1Factors and levels

2.2 正交试验结果与分析

正交试验结果如表2所示。结果分析采用方差分析法，方差分析表见表3。

表2 正交试验结果Table 2The results of orthogonal experiment

表3 正交试验方差分析结果Table 3Variance analysis of orthogonal experiment

由表2和表3可知，3个因素对多糖含量的影响的主次顺序为：发酵时间＞料液比＞接种量。A因素以A2水平最适，B因素以B3水平最适，C因素以C3水平最适，因此最佳发酵条件为：料液比1∶9（g/mL），接种量3.0%，发酵时间9 d。料液比和发酵时间对多糖含量有较为显著的影响，接种量也有影响，显著性低于料液比和发酵时间[13]。较高的接种量和较长的发酵时间有利于发酵过程中羊肚菌的生长，较低的料液比可以防止一定程度的杂菌污染，有利于发酵过程的进行。

2.3 优化条件的验证

因为由正交试验优化出的发酵条件在正交试验表中没有出现，所以需要进行补充验证试验，验证试验的结果见表4。

表4 验证试验结果Table 4Validation experiment results

结果显示该条件下得到的发酵物中多糖含量是最高的，说明通过正交试验优化得到的最优条件是有效的。

2.4 CMP结合胆酸盐能力的评价

绘制的无水胆酸钠标准曲线见图2，脱氧胆酸钠标准曲线见图3，牛磺胆酸钠标准曲线见图4。

图2 无水胆酸钠标准曲线Fig.2Standard curve of binding sodium cholate capacity

图3 脱氧胆酸钠标准曲线Fig.3Standard curve of binding sodium deoxycholate capacity

图4 牛磺胆酸钠标准曲线Fig.4Standard curve of binding sodium taurocholate capacity

由图2～图4可以知道，3种胆酸盐的标准曲线在一定浓度范围内都呈现出良好的线性关系。

CMP对各种胆酸盐结合能力比较见表5。

表5 CMP对各种胆酸盐结合能力比较Table 5Binding capacity of CMP towards the different sodium cholates

由表5可以看出，样品对3种胆酸盐都有结合效果，其中脱氧胆酸钠的结合量最高，可达到（0.16± 0.02）mmol/L。这可能是因为脱氧胆酸钠的羧基在经肠胃模拟环境处理后的消化液中更易离子化，其活性基团更易暴露出来，与CMP发生疏水键、静电力和氢键间的相互作用，其中氢键间相互作用可能是主要的作用形式[14]。CMP表现出对各种胆酸盐的强结合作用，可以初步证明它有降血脂功能。

2.5 CMP体外抗氧化性的评价

2.5.1 DPPH自由基清除率

DPPH自由基清除率见图5。

图5 CMP对DPPH自由基的清除率Fig.5Scavenging activity of CMP against DPPH free racdical

由图5可以看出，在浓度为0.5 mg/mL～10 mg/mL的范围内，CMP的DPPH自由基清除率随着浓度的升高而增大。当浓度为10 mg/mL时，VC和CMP的清除率分别为95.8%和40.9%，表明CMP对DPPH自由基有一定的清除能力。

2.5.2 羟自由基清除率

羟自由基清除率见图6。

图6 CMP对羟自由基的清除率Fig.6Scavenging activity of CMP against hydroxy free racdical

羟自由基是人体内最活跃的活性氧自由基，它会诱导许多病理变化。由图6可知，在测定浓度范围内，样品对羟自由基的清除率随浓度增大而增大。在浓度为10 mg/mL时，VC和样品的清除率分别为99.5%和98.9%，样品对羟自由基的清除能力略低于VC。

3 结论

以豆渣为培养基，研究羊肚杆菌半固体发酵豆渣生产多糖的工艺条件，在料液比1∶9（g/mL），接种量3.0%，发酵时间9 d的最优条件下，多糖含量达到8.86%，这为用羊肚杆菌大规模低成本的工业化发酵生产提供了参考和理论数据，也为豆渣的再利用提供了新思路。还对CMP的功能性进行研究，证明CMP具有一定的抗菌性和较高的抗氧化性。

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Utilization of Soybean Curd Residue for Polysaccharides Production by Morchella esculenta and Evaluation of the Functional Properties

YAO Heng，ZHU Hui，CHEN Ye，LI Shu-hong*
（College of Food Engineering and Biotechnology，Tianjin University of Science&Technology，Tianjin 300457，China）

The semisolid fermentation by Morchella esculenta using soybean curd residue was studied.Orthogonal experimental design was employed to optimize the fermentation conditions.The optimal fermentation condi tions achieved for crude polysaccharide production 8.86%were feed liquid ratio 1∶9（g/mL），inoculum size 3.0%and fermentation time 9 days，respectively.The crude polysaccharide（CMP）was extracted from the fermentation substrate，then the function of CMP was evaluated.The results on the ability of bile salt-binding showed that CMP had binding capacities for three kinds of cholates（anhydrous cholate，deoxycholate，taurocholate），which demonstrated that CMP had hypolipidemic effect.Meanwhile，CMP exhibited a positive antioxidant activity.

Morchella esculenta；semisolid fermentation；polysaccharides；functional properties

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.09.033

2016-08-13

姚珩（1990—），女（汉），硕士研究生，研究方向：农产品加工及贮藏工程。

*通信作者：李书红，女，讲师。