高通量免疫组库测序技术在血液系统肿瘤中的应用进展

沈凤娇++高清平++叶柏新

[摘要] 高通量免疫组库测序技术是通过对B细胞受体（BCR）或者T细胞受体（TCR）的互补决定区（CDR）进行深度测序，借助相关数据分析方法，全面解析T或B细胞识别抗原的多样性，从而衍生为一种从组学角度理解适应性免疫机制的研究方法，其在抗体研发、感染免疫、肿瘤免疫等领域有重要的应用价值。在恶性T或B淋巴细胞肿瘤表面表达单克隆TCR或BCR分子，利用高通量免疫组库测序技术系统性分析TCR或BCR，发现特定的CDR基因序列，从而为T或B淋巴细胞肿瘤诊断、微小残留病灶监测提供一种新方法，此外，高通量免疫组库测序技术也为造血干细胞移植后免疫重建评估提供一种新的方法。本文就高通量免疫组库测序技术在血液系统肿瘤中的应用作一综述。

[关键词] 免疫组库测序技术；血液系统肿瘤；微小残留病灶；造血干细胞移植

[中图分类号] R733 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）04（b）-0030-05

[Abstract] High-throughput immune repertoire sequencing technology makes systemic analysis of the diversity of T or B cell recognizing antigen through deep-sequencing the complementarity determining regions （CDRs） of B cell receptor （BCR） or T cell receptor （TCR）， in virtue of related data analysis method， thus derived for a study method for understanding the immunity from the omics angle， which plays an important role in the areas of antibody discovery， infection and cancer immunity. Generally， T or B cell-malignancies originate from a single clone which expresses a TCR or BCR. High-throughput immune repertoire sequencing can be used to make systemic analysis of TCR or BCR， and identify the specific CDR sequence， thus to provide a novel method for the diagnosis of T or B cell malignancies and the monitor of minimal residue diseases. In addition， high-throughput immune repertoire sequencing technology also provides a novel method for the evaluation of immune reconstitution after hematopoietic stem cell transplantation. This paper reviews the application of high-throughput immune repertoire sequencing in hematological malignancies.

[Key words] Immune repertoire sequencing technology； Hematological malignancy； Minimal residual disease； Hematopoietic stem cell transplantation

免疫組库是指在任何特定的时间内，机体所有有功能的B细胞和T细胞的总和[1]。人体的适应性免疫系统主要依靠于T淋巴细胞和B淋巴细胞表面的T细胞受体（TCR）和B细胞受体（BCR）上的互补决定区（CDR）与MHC-抗原肽分子进行识别并特异性结合。由于人体基因组有限，不能编码足够数量的受体基因来对外界各种各样的抗原产生免疫保护作用[2]，但编码T细胞表面TCR上的CDR区VDJ基因发生重排，B细胞在接受抗原刺激后经历VDJ基因重排、体细胞高频突变、抗体类别的转换，形成了TCR和BCR的多样性[3]，这一方面形成了机体对外来多种抗原具有免疫性的结构基础，另一方面也对系统及全面解析TCR及BCR库产生了巨大的挑战。恶性B或T淋巴肿瘤细胞表面表达单克隆性BCR或TCR受体，有研究表明对BCR或TCR进行测序可用于诊断B或T淋巴细胞恶性肿瘤及追踪治疗后效果[4]，因此利用免疫组库测序技术分析机体免疫系统多样性及疾病发生发展过程具有重要意义。近年来，利用高通量免疫组库测序技术对BCR或TCR上的CDR3区重排基因序列进行深度测序，从而为T或B淋巴细胞白血病及淋巴瘤的诊断、微小残留病灶的监测以及造血干细胞移植术后免疫系统重建评估提供了一种新的方法。

1 免疫组库及免疫组库测序技术

1.1 免疫组库介绍

人体正常的免疫系统依赖于B细胞或T细胞表面BCR（TCR）对抗原特异性识别并结合。BCR是由两条相同重链和两条相同轻链构成[8]（图1），Ig轻链和重链及其C区和V区分别由定位于不同染色体的多个不连续基因片段所编码：C基因片段编码恒定区；V基因片段编码可变区，V区由3个互补决定区（CDR1、CDR2和CDR3）组成，CDR区基因组成和排列顺序呈现高度多样性，在同一个体内，这种多样性可达109～1012，构成容量巨大的BCR库。正是由于这种重大BCR库才使机体对众多外来异物有免疫性[5]。TCR包括TCRαβ和TCRγδ两类，分别由α、β、γ、δ链组成，α和β链的V区包含3个互补决定区CDRs和4个框架区FRs，其中CDR区是细胞的高变区，与抗原特异性结合，CDR1、CDR2由V基因编码，而CDR3由VDJ三个基因编码，在免疫细胞成熟过程中VDJ基因发生重排从而形成了TCR多变性[6]。据理论上估计，TCRαβ受体在胸腺中超过1018，考虑到体细胞高频突变，BCR受体更加多样化[7]。正是由于BCR及TCR的多样性，因此在正常免疫系统中，机体对外来多种抗原分子及肿瘤抗原产生免疫作用。而在恶性B或T淋巴细胞肿瘤中，通过对CDR3区基因序列的研究，可对疾病诊断、监测、预后具有重要意义。

1.2 免疫组库测序技术发展

在20世纪90年代，免疫扫描谱型分析被用来对BCR和TCR进行研究[9]，Gorski利用免疫扫描谱型分析技术来分析TCRbeta链基因多样性，并指出其多样性与机体的免疫功能状态相关。而利用B细胞或T细胞V-J基因配对组合，可测出CDR3的长度[10]，虽然价格相对便宜，但是对CDR3序列研究仍然相对模糊。随后出现了Sanger测序是对编码BCR或TCR上可变区的DNA片段进行测序，但测序的数量相对有限，制约了该技术的应用与推广。流式免疫分析技术及CDR3扫描分析技术可将B细胞或T细胞分开，进而弥补了Sanger测序在数量上受限的不足，随后研究通过有限稀释方法，将单个B细胞抗体基因克隆并表达，研究特定抗体的特性和功能，进而分离疾病相关抗体，特别是分离出与病原体相关抗体[12]。而相比Sanger测序技术，以Roche454[13]、Illuminasolexa[14]为代表的二代高通量测序技术目前应用最广，其主要依赖DNA模板PCR扩增，以增强荧光捕捉信号，利用二代高通量免疫组库测序技术，可得到难以预测的深度、分辨度和精度，但二代测序技术需要逆转录及PCR扩增[15]。而随后出现的以Helicos[16]单分子测序为代表的三代测序方法，是不需要进行PCR扩增，直接检测单个碱基信号，相比于二代测序技术，三代测序技术准确率更高。这些免疫测序技术用于VDJ基因装配和CDR识别，通过对基本数据的统计如：Highv-QUEUST[17]、免疫组库对比分析、对CDR序列碱基片段插入、缺失分析，并将CDR序列翻译成肽段，并构建免疫组库表达谱，绘制V/J或者V/D/J表达的2D、3D图谱[18]。

二代高通量测序技术具有较高的敏感性、特异性，并同时监测多个克隆基因序列的表达，其应用最广，近年来利用高通量免疫组库测序技术在血液系统肿瘤中应用取得了一些新的进展，从而为血液系统肿瘤诊断、监测提供了一种新的方法。此外，高通量免疫组库测序技术也被应用于感染免疫、自身免疫性疾病[19]、抗体研发等方面。

2 免疫组库测序技术在血液系统肿瘤中的应用

2.1 免疫组库测序技术在血液系统肿瘤的诊断中的应用

血液系统肿瘤是由于基因发生突变引起的，在不同表型基础上，基因发生已知或未知的突变，从而造成血液系统肿瘤的发生[20-22]。而利用高通量测序技术对B或T淋巴细胞CDR3基因序列进行深度测序，可对血液系统肿瘤进行诊断。急性B淋巴细胞白血病是一类来源原始幼稚B淋巴细胞的恶性克隆性疾病[23]，早前的研究[24]已经证实了在急性B淋巴细胞白血病患者中克隆性免疫球蛋白基因序列演变进展，B细胞在发生恶变后可能经历了免疫球蛋白重链基因重排，在缓解期对克隆性免疫球蛋白重链重排基因序列的监测有助于对急性淋巴细胞白血病的诊断及药效评估。Gawad等[25]利用高通量免疫组库测序技术及IMGT数据分析技析，发现43例患儿克隆性免疫球蛋白重链基因发生重排，其中每例患儿克隆性免疫球蛋白基因序列表型从0到4024不等，也证实了克隆性免疫球蛋白重链基因重排序列为白血病患儿特定的克隆性基因序列，而这可能为白血病诊断以及微小残留病灶的监测提供一种新的方法。Oki等[26]利用高通量免疫组库测序技术对17例经典霍奇金淋巴瘤进行基因测序，在12例已经组织活检确诊为淋巴瘤的患者中找到了淋巴细胞特定的基因序列，而这些患者中11例可找到外周血样本，其中的8例患者在外周血样本中找到了肿瘤细胞特定的基因序列，这些数据也表明了利用高通量测序技术对肿瘤细胞特定的基因检测的可行性，而且对未来霍奇金淋巴瘤的诊断及治疗提供了一种新的方法。

2.2 免疫組库测序技术在微小残留病灶的监测中的应用

在急性淋巴细胞白血病中，微小残留病灶作为公认的最好的独立预后因素[27]，而起初定义微小残留病灶是用它来评估治疗效果，后来被用来监测肿瘤早期复发[28]。当前对急性淋巴细胞白血病的监测方法包括利用流式免疫方法对白血病异常免疫表型的监测，其敏感性高达0.01%，利用等位基因特异性寡核苷酸聚合酶链式反应（ASO-PCR）对免疫球蛋白及和TCR基因检测，其敏感性高达0.001%[28]，虽然这些方法在临床上证明可行，但是利用流式免疫技术及多重聚合酶链反应在白血病治疗过程中监测不同白血病亚克隆发展有一定局限或者是不能检测出，因而可能会导致错误的结果。而利用高通量免疫组库测序技术对克隆性免疫球蛋白或TCR重排基因序列（白血病特定的基因序列）进行监测有助于急性淋巴细胞白血病微小残留病灶诊断，Faham等[32]利用高通量免疫组库测序技术对106例急性B淋巴白血病患者进行微小残留病灶监测，实验监测微小残留病灶金标准是利用流式免疫细胞术和ASO-PCR技术，研究发现高通量测序技术检测出微小残留病灶的28例患者在利用流式免疫细胞术也证实为阳性，也发现了高通量测序技术检测出的36例患者中利用ASO-PCR技术诊断35例阳性，在另外10例和3例患者中利用流式细胞术及ASO-PCR均未检测出微小残留病灶，而利用高通量免疫组库测序技术却检测出，从而证明了免疫组库测序技术对淋巴细胞恶性肿瘤的微小残留病灶检测具有高度敏感性及准确性。同时也有研究证明利用高通量免疫组库测序技术可对急性T淋巴细胞白血病微小残留病灶监测[33]。恶性B细胞表面的BCR分子充当细胞表面标志物，通过对外周血、骨髓中抗体组库可变区基因序列研究，对肿瘤的早期诊断、病情发展以及复发均有重要意义。

2.3 免疫组库测序技术在评价骨髓移植后免疫重建过程中的应用

造血干细胞移植是血液系统肿瘤最有效的治疗方法，一方面移植后的骨髓造血干细胞能重建免疫功能，来抵抗异常的肿瘤细胞，另一方面移植后的T细胞能够识别肿瘤相关抗原，并将这些异常的肿瘤细胞清除[34]。近年来，利用TCR或免疫球蛋白基因测序研究可用来评估造血干细胞移植术后T细胞和B细胞免疫重建状况。van Heijst等[35]利用测序技术对28例造血干细胞移植术后的进行TCR多样性监测，6个月后，对脐血移植受者TCR多样性进行检测，其多样性接近于正常人，而T细胞耗尽的外周血造血干细胞移植患者CD4和CD8T细胞多样性是较低时的28倍和14倍，一年后，移除T细胞患者的CD4T细胞TCR受体多样性提高，但CD8T细胞多样性并未提高，因此对造血干细胞移植后TCR的监测有助于评价患者移植后免疫重建情况，进而对移植后肿瘤复发及感染风险进行有效的监测。Logan等[36]利用高通量免疫组库测序技术通过对移植后慢性粒细胞白血病患者外周血免疫球蛋白重链VJ重组基因序列研究发现在移植后56、180、365、550 d后，肿瘤恶性克隆基因表型数量越来越低，从而证明了利用高通量免疫组库测序技术对造血干细胞移植术后免疫球蛋白重链基因测序分析可定量评估移植术后免疫系统重建，也证实了对免疫组库多样性定量评估对临床上移植术后免疫组库重建分析有重要的意义，这种免疫组库重建与疾病预后、生存期、移植物抗宿主病及感染密切相关，因此利用高通量免疫组库测序技术对血液系统肿瘤患者造血干细胞移植后免疫系统重建状况进行有效的评估，从而对肿瘤的复发及感染等疾病具有重要的意义。

3 總结与展望

从传统的流式细胞术、免疫扫描谱系分析技术再到高通量测序转变，免疫组库测序技术发生了革命性发展，随着扩增技术、测序技术和数据分析技术不断进步，免疫组库测序技术将在血液系统肿瘤早期诊断、治疗及评价中发挥越来越重要的作用，通过对TCR及BCR受体库分析，从DNA分子水平对肿瘤发生发展进行解读，进而能为肿瘤复发、微小残留病、造血干细胞移植后免疫重建评估带来了新的希望。但由于BCR和TCR重排复杂性和CD受体库多样性，高通量测序的深度及对庞大数据解读和应用研究，会有很多难题，因此免疫组库技术目前应用较少，还未用于临床诊疗疾病。

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（收稿日期：2016-12-28 本文編辑：张瑜杰）