RNA恒温扩增法在肺炎支原体检测中的应用

周杰，张莉，张鲍虎，黄伟忠，徐康立，张扬

(深圳市坪山新区人民医院检验科，广东 深圳 518118)

RNA恒温扩增法在肺炎支原体检测中的应用

周杰，张莉，张鲍虎，黄伟忠，徐康立，张扬

(深圳市坪山新区人民医院检验科，广东 深圳 518118)

目的 探讨RNA恒温扩增法检测肺炎支原体的可行性及其应用价值。方法采集2016年5～7月在我院住院治疗的200例患急性呼吸道感染儿童咽拭子，分别用RNA恒温扩增法和PCR荧光探针法进行肺炎支原体检测，分别计算两种检测方法的检出率，根据公式计算灵敏度和特异性，并进行统计学分析。结果RNA恒温扩增法检出肺炎支原体17例，检出率为8.5%，PCR荧光探针法检出肺炎支原体18例，检出率为9.0%，两种方法的检出率比较差异无统计学意义(P>0.05)；RNA恒温扩增法与PCR荧光探针法相比灵敏度为88.9%、特异度为99.5%。结论RNA恒温扩增法与PCR荧光探针法检出率相当，具有较高的灵敏度和特异度，可以作为一种新的方法用于肺炎支原体临床检测。

RNA恒温扩增法；PCR荧光探针法；肺炎支原体

肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae，MP)是没有细胞壁，能通过滤菌器，可在无生命培养基培养增殖的介于病毒和细菌之间的原核细胞型微生物[1]。MP青少年易感，主要经呼吸道感染，可引起支气管炎，常伴有上呼吸道感染症状，约30%的感染者可引起肺炎，个别患者并发呼吸道以外的疾病，如脑膜炎、心包炎、皮疹等[2]。目前检测MP的方法有多种，如血清学检测、快速培养法等，但均存在不同的缺陷，如血清学检测阳性率易受患者免疫力水平的影响，快速培养法检测结果易受到送检标本中其他病原体的干扰。核糖核酸(ribonucleic acid，RNA)恒温扩增法是一种新兴的检测方法，具有敏感度高、针对活菌检测的特点，但其检测性能需要进一步验证。本文拟收集我院近年来临床诊断为急性呼吸道感染的标本，以目前临床较认可的聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)荧光探针法作为对照，分析其灵敏度和特异度，探讨该方法在临床诊断中的应用价值，现报道如下：

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集于2016年5～7月在我院儿科住院的200例临床诊断为急性呼吸道感染的儿童咽拭子标本，其中男性123例，女性77例，年龄1个月～13岁。所有患者均在入院当天采集咽拭子送检，标本接收后立即用1 mL生理盐水进行病原体洗脱，洗脱液分装成2份放-20℃冰箱待检。

1.2 仪器与试剂 检测仪器均为美国ABI 7500型实时荧光定量PCR仪，RNA恒温扩增法试剂采用上海仁度生物技术有限公司MP核酸检测试剂盒，PCR荧光探针法试剂采用中山大学达安基因股份有限公司MP核酸检测盒。

1.3 方法

1.3.1 RNA恒温扩增法 将冻存标本恢复室温后加500μL裂解液，100μL核酸提取液加入400μL裂解后样本中，同时设置阴阳性对照。60℃恒温5 min后室温放置10 min，然后置于磁珠分离装置上静置5 min，吸净管盖及管中的气泡和液体，洗涤液洗涤2次，加入40μL扩增液，震荡混匀，取30μL磁珠悬液至新的微量反应管中，60℃恒温10 min，42℃恒温5 min，加入10μL扩增酶，放入核酸扩增仪进行检测。反应程序：采用FAM荧光通道，42℃1 min，40个循环，并进行溶解曲线分析。设定阈值后分别读取每个样本的dt值(RNA扩增循环数)。dt值≤35设定为阳性，dt值≥40设定为阴性；dt值在35～40之间的样本重新扩增后，设定dt值≤35为阳性，dt>35为阴性。

1.3.2 PCR荧光探针法 将冻存标本室温放置后，12 000 r/min离心5 min后去上清，沉淀加入50μL脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，DNA)提取液，100℃干浴10 min后12 000 r/min离心5 min，吸取上清液。反应管中加入2μL上清液、40μL反应液、3μL扩增酶供扩增。反应程序：采用FAM荧光通道，93℃2 min，1个循环；93℃45 s，55℃60 s，10个循环；93℃30 s，55℃45 s，30个循环。设定阈值后分别读取每个样本的ct值(DNA扩增循环数)，设定ct值<30为阳性。

1.4 统计学方法 应用SPSS16.0统计软件对数据进行统计分析，率的比较采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1两种检测方法的检出率比较 200份咽拭子标本分别进行RNA恒温扩增法与PCR荧光探针法检测，其中RNA恒温扩增法检出肺炎支原体17例，检出率为8.5%，PCR荧光探针法检出肺炎支原体18例，检出率为9.0%，RNA恒温扩增法与PCR荧光探针法检出率进行χ2检验，差异无统计学意义(χ2=0.031，P>0.05)。

2.2 两种检测方法的灵敏度和特异比较 以PCR荧光探针法的检出阳性率和阴性率作为对照，根据公式计算RNA恒温扩增法的相对灵敏度和特异度，结果显示RNA恒温扩增法的灵敏度为88.9%，特异度为99.5%，见表1。

表1 RNA恒温扩增法与PCR荧光探针法检测肺炎支原体结果(例)

3 讨 论

肺炎支原体是引起上呼吸道感染、急性支气管炎、支气管哮喘、肺炎等临床疾病一种病原体，肺炎支原体肺炎是小儿肺炎的常见类型之一，是由MP引起的间质性肺炎，多有发热、头痛、咽喉痛及剧烈咳嗽等症状，同时还常伴有广泛多器官、多系统的肺外合并症[3-6]。儿童感染MP临床表现不典型，易与病毒性感冒等疾病相混淆，容易被误诊而延误治疗，因此如何快速准确检测出MP对临床正确诊断病情有重要的帮助。

MP的实验室检测方法目前是MP传统培养法、MP快速培养法、血清学抗体检测以及PCR技术等。MP传统培养法虽然是检测MP的金标准，但由于其培养条件要求高、敏感度低、培养时间长，不能满足临床快速诊断的要求，限制了其临床应用。MP快速培养法采用的是液体培养，根据液体培养基的颜色变化来判断阴阳性，但是当有其他病原体生长繁殖时也可以引起颜色变化而造成假阳性[7]。王楠等[8]对95例肺炎支原体快速培养阳性标本进一步分析，发现其中有88例为真菌、1例为肺炎链球菌、1例为流感嗜血杆菌。血清学抗体检测方法虽然简便易操作，但是存在检测窗口期的问题，MP抗体一般出现在感染1周后，3～4周达高峰，因此早期诊断敏感性不高；而且检测结果易受患者年龄、免疫功能等因素造成的低水平免疫应答的影响[9]。PCR荧光探针法可直接检测患者咽部分泌物中肺炎支原体DNA，具有很高的敏感性和特异性，可用于MP感染的早期诊断[10]，但是治疗后短期内局部有肺炎支原体DNA残余，容易影响临床疗效的观察，同时由于操作人员的不规范容易引起实验室DNA污染而影响结果。

RNA恒温扩增法是新一代的核酸检测技术，其特点是以MP的RNA为靶标进行恒温扩增检测。因为RNA仅在活菌中存在，MP死亡后RNA快速降解，因此采用该方法进行MP检测，如果阳性提示MP近期感染，而不是既往感染[11-12]。本研究以PCR荧光探针法作为参照，与该检测方法对比显示RNA恒温扩增法检测MP的相对敏感度和特异度分别为88.9%和99.5%，提示其具有良好的诊断价值。本研究中有2例RNA恒温扩增法检测阴性而PCR荧光探针法检测阳性，收集临床资料进一步分析，发现这2例患儿入院前已经应用抗生素治疗，推测原因可能为MP被杀死后特异性RNA被降解但特异性DNA可能还持续存在一段时间，从而造成检测结果的差异。

综上所述，RNA恒温扩增法在MP检测中具有较高的敏感性和特异性，且只能检测出活的肺炎支原体，可以作为一种新的方法用于MP临床检测。

参考文献

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[6]陈开革,黎石宝.肺炎支原体感染研究新进展[J].中国病原生物学杂志,2013,8(5):473-475.

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[8]王楠,张国成,许东亮.95例肺炎支原体快速液体培养阳性标本分析[J].现代生物医学进展,2010,10(8):1477-1478.

[9]石小华.肺炎支原体抗体与荧光定量PCR检测法的比较[J].检验医学与临床,2010,7(5):412-413.

[10]孟凡亮,何利华,顾一心,等.实时荧光定量-聚合酶链反应方法检测肺炎支原体[J].疾病监测,2013,28(3):209-212.

[11]郭丽,孙琳,郭琰,等.肺炎支原体RNA检测在儿童肺炎支原体肺炎疗效监测中的应用价值[J].中国循证儿科杂志,2016,11(2): 109-112.

[12]沙巍,何娅,蒋瑞华,等.实时荧光核酸恒温放大检测(SAT)法对肺结核诊断价值的研究[J].中国防痨杂志,2012,34(6):377-379.

Application of isothermal RNA amplification in the detection of Mycoplasma pneumoniae.

ZHOU Jie,ZHANG Li, ZHANG Bao-hu,HUANG Wei-zhong,XU Kang-li,ZHANG Yang.Department of Clinical Laboratory,Pingshan New District People's Hospitalof Shenzhen,Shenzhen 518118,Guangdong,CHINA

ObjectiveTo explore the feasibility and clinical value of isothermal RNA amplification in the detection of Mycoplasma pneumoniae.MethodsA total of 200 patients with acute respiratory tract infection,who admitted to our hospital from May 2016 to July 2016,were selected as the research subjects.Mycoplasma pneumoniae was detected by the method of isothermal RNA amplification and PCR fluorescence probe respectively.The detection rate of Mycoplasma pneumoniae of the two methods was calculated.The sensitivity and specificity were statistically analyzed according to the specific formula.ResultsSeventeen cases of Mycoplasma pneumoniae were detected by isothermal RNA amplification method with 8.5%of detection rate;eighteen cases of Mycoplasma pneumoniae were detected by PCR fluorescence probe method with 9.0%of detection rate;there was no significant difference between the two methods in the detection rate(P>0.05).Compared to PCR fluorescence probe,the sensitivity and specificity of isothermal RNA amplification were respectively 88.9%and 99.5%.ConclusionIsothermal RNA amplification has nearly equivalent detection rate with PCR fluorescence probe buthigher sensitivity and specificity,which can be used as a new method for detecting Mycoplasma pneumoniae clinically.

Isothermal RNA amplification;PCR fluorescentprobe;Mycoplasma pneumoniae

R563.1

A

1003—6350（2017）09—1433—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.09.021

2016-11-16)

广东省深圳市坪山新区医疗卫生发展孵化资助项目(编号：201328)

张莉。E-mail：doudouding722@126.com