牛卵泡可卡因-苯丙胺调节转录肽候选受体的筛选

王锴，孟金柱，李鹏飞，毕锡麟，景炅婕，张子宁，吕丽华*

(1.山西农业大学 动物科技学院，山西 太谷 030801； 2.山西农业大学 生命科学学院，山西 太谷 030801)

牛卵泡可卡因-苯丙胺调节转录肽候选受体的筛选

王锴1，孟金柱1，李鹏飞2，毕锡麟1，景炅婕1，张子宁2，吕丽华1*

(1.山西农业大学 动物科技学院，山西 太谷 030801； 2.山西农业大学 生命科学学院，山西 太谷 030801)

[目的]本研究旨在筛选牛卵泡可卡因-苯丙胺调节转录肽(cocnine-and amphetamine-regulate transcript, CART)候选受体。[方法]首先对牛卵泡转录组深度测序所获得的35 325个表达基因进行筛选，选出ODF1/ODF2(发情周期第一卵泡波的最大卵泡/第二大卵泡)趋近于无穷大的部分和比值在1.5～2.0之间的部分基因，找出它们的gene symbol，然后利用NCBI和CELLULAR进行亚细胞定位，最后利用跨膜螺旋软件进行α跨膜螺旋区预测，从中筛选出含有7个α螺旋跨膜区的膜蛋白，进而筛选出CART的候选受体。[结果]通过差异表达基因的筛选、亚细胞定位和跨膜螺旋区预测最终获得了11个高表达基因，并根据筛选出的23个G蛋白偶联受体的结构和功能，结合神经肽受体的特征，找出了4个G蛋白偶联受体作为CART的候选受体。[结论]最终将AGTR2、 HTR2B、 S1PR1、 S1PR2作为CART的候选受体，为以后进一步研究奠定了基础。

牛卵泡； CART； 候选受体； 跨膜螺旋； 表达基因； G蛋白偶联受体

牛排卵少，繁殖周期长，繁殖率较低，而且繁殖率的高低直接影响着畜牧业的经济效益。目前，提高牛繁殖率很重要的一种方法是提高它的排卵率。Sen等[1]研究证明，在牛的卵巢上有可卡因-苯丙胺调节转录肽(Cocnine-and amphetamine-regulate transcript, CART) mRNA的表达，主要是在牛的卵泡颗粒细胞上有表达，研究证明CART在一定浓度下对卵泡的发育有着明显的负调控作用，引起牛卵泡的闭锁，导致牛繁殖率下降。因此，如果能够解除这种卵泡闭锁作用，牛的排卵率就会提高，繁殖率也会相应提高。针对此情况，通过对CART做进一步的研究，用某种物质和CART竞争性地与CART靶位点(CART受体)结合，即可减少或阻止由于CART与其靶位点结合而产生的卵泡闭锁现象，从而提高成熟卵泡的个数，起到超数排卵的作用。CART最初是由Kobayashi 等[2]在牛卵巢中发现的，并经研究发现其对卵泡闭锁有调节作用[3]。Sen等[1]利用G蛋白和蛋白激酶抑制剂对牛卵泡上CART的信号传导通路做了进一步的研究，证明CART对FSH信号通路的多个环节、E2分泌和卵泡发育及闭锁以及对深刻理解CART潜在的对内外生殖系统的作用机制具有重要意义。Sen、吕丽华等[4]提出了牛卵泡颗粒细胞内CART作用机制的模型，这一研究成果以对CART信号传导通路的研究为基础。吕丽华等[5]通过对比出现偏差后的DF和SF，检测出SF内CART含量高于DF内CART含量，之后证明了CART可引起单胎动物的卵泡闭锁。本研究运用CELLO v2.5和HMMTOP v2.0方法对筛选出的部分基因进行亚细胞定位和跨膜α螺旋区预测，分析跨膜区找出G蛋白偶联受体，进而筛选出CART候选受体，为CART功能的进一步研究奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 主要材料

牛卵泡转录组ODF1(发情周期第一卵泡波中最大卵泡)和ODF2(第二大卵泡)深度测序获得的表达基因(35 325个)。

1.2 分析方法

1.2.1 筛选差异表达基因

从35 325个基因中筛选出ODF1/ODF2趋近于无穷大的部分和比值在1.5～2.0之间的部分基因(其他部分的基因已经研究过)，然后找出gene symbol。

1.2.2 亚细胞定位

利用NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)和CELLULAR(http://cello.life. nctu.edu.tw/)进行亚细胞定位。使用NCBI时，在NCBI主页上All Databases下拉框处选择gene或protein，在右侧搜索框里填上需要搜索基因的名字，空格后输入bos，得到的就是这个基因在牛这个物种里面的序列，从中选择一个序列最长的，然后单击FASTA搜索引擎，会出现整个基因的全序列，将整个基因的全序列复制。打开CELLULAR(http://cello.life.nctu.edu.tw/)网址的主页，在ORGANISMS中选择Eukaryotes，在SEQUENCES中选择DNA或Protein，然后将该基因的FASTA序列输入CELLO V2.5对话框，单击提交，进行亚细胞定位。

1.2.3 G蛋白偶联受体的预测

利用跨膜螺旋软件(http://www.enzim.hu/hmmtop/html/submit.html)进行跨膜α螺旋区预测，分析跨膜区，筛选出含有7个α螺旋跨膜区的膜蛋白。

1.2.4 CART候选受体的筛选

从以上筛选出来的G蛋白偶联受体中，根据其结构功能进行筛选，找出与卵泡闭锁和细胞凋亡等有关的作为CART的候选受体。

2 结果与分析

2.1 差异表达基因筛选结果

从35 325个基因中筛选出ODF1/ODF2趋近于无穷大的部分和比值在1.5～2.0之间的11个高表达基因(表1)。

2.2 CART表达产物亚细胞定位预测结果

统计结果显示：细胞质膜蛋白(Plasma Membrane)占15.79%，细胞核蛋白(Nuclear)占42.98%，细胞外蛋白(Extracellaler)占13.14%，高尔基体蛋白(Golgi)占0.25%，细胞质蛋白(Cytoplasmic)占16.46%，线粒体蛋白(Mitochondrial)占9.23%，叶绿体蛋白(Chloroplast)占1.83%，内质网蛋白(ER)占0.08%，溶酶体蛋白(Lysosomal)占0.08%，细胞骨架蛋白(Cytoskeleta)占0.16%，其中细胞质膜蛋白有190个。

2.3 跨膜α螺旋区预测结果

利用http://www.enzim.hu/hmmtop/html/submit.html软件进行跨膜α螺旋区预测，分析跨膜区，做柱状图，如图1所示，190个细胞质膜蛋白中含有7个α螺旋跨膜区的细胞质膜蛋白有23个。

表1 ODF1/ODF2趋近于无穷大且比值在1.5～2.0之间的11个高表达基因

图1 190个细胞质膜蛋白跨膜α螺旋区预测结果Fig.1 The result of transmembrane α helix prediction of 190 membrane proteins

2.4 G蛋白偶联受体筛选结果

应用HMMTOP v2.0对深度测序结果中筛选出来的膜蛋白进行G蛋白偶联受体的筛选，结果筛选出的含有7个α螺旋跨膜区的膜蛋白有23个，因此这23个膜蛋白就是G蛋白偶联受体。如表2所示。

3 讨论

目前的研究表明，虽然CART受体的分子特性还不明确，但是可以肯定，CART的生物学作用是由受体来介导的。Joseph等[6]在研究牛卵泡颗粒细胞E2产生过程中CART信号通路时，也证明了CART生物学作用的实现是由受体来介导的，其受体可能是G蛋白偶联受体。本试验通过对以上23种G蛋白偶联受体功能的分析，结合神经肽受体的特征(分子量一般为40 000～50 000 Da，组成蛋白的氨基酸序列少于500)，将AGTR2、S1PR2、HTR2B、S1PR1作为CART的候选受体。

AGTR2编码的蛋白质在肾素-血管紧张素系统中起一定的作用。肾素-血管紧张素系统在维持水、电解质平衡、内环境的稳态及调节血压稳定中起着关键作用[7]。当作为肾素-血管紧张素系统中最重要介质的血管紧张素Ⅱ与其特异性受体结合时，会对心脏和血管功能、结构和体循环血流动力学产生显著的影响[8]。该膜蛋白已被证明能够介导程序性细胞死亡和细胞凋亡[9]。该功能可能在发育生物学和病理生理学中发挥重要作用。

S1PR2(鞘氨醇-1-磷酸酯受体-2)是一种蛋白质编码基因，该基因编码的蛋白质参与鞘氨醇-1-磷酸诱导的细胞增殖，存活和转录的激活，同时可引发对大多数类型细胞和组织的不同生理功能[10]。对细胞骨架重塑和形态的变化也有一定的调节作用。

HTR2B编码的蛋白质会影响神经活动，对胚胎心肌细胞和心脏的正常发育和增殖发挥作用，可防止心肌细胞凋亡，还可能对肺动脉慢性缺氧具有一定的收缩作用，同时维持正常成骨细胞的功能和增殖以及正常的骨质密度[11]。

表2 筛选出的23个含有7个α螺旋跨膜区的膜蛋白

S1PR1(鞘氨醇-1-磷酸受体-1)(S1P受体1或S1P 1)，也被称为内皮分化基因1(EDG1)，它属于鞘氨醇-1-磷酸受体亚家族，该基因编码的蛋白质是细胞膜鞘磷脂的代谢产物之一，它最初被鉴定为大量存在于内皮细胞，在调节内皮细胞的细胞骨架结构中起重要作用，同时与细胞增殖、凋亡和迁移等有着极为密切的关系[12]。在多种恶性肿瘤形成、转化和进展过程中都发挥着重要的作用，也可以调控肿瘤细胞的增殖、凋亡以及血管的新生[13]。

对于以上4种CART的候选受体，还需要做进一步研究来确定其功能。结构基因功能最终是通过其表达的蛋白质来体现的，因此基因沉默技术就可以作为一种强有力的研究工具用于功能基因组的研究，它是真核生物细胞基因表达调节的一种重要手段，随着基因组学时代的到来，基因沉默技术作为有效、经济的分析基因功能的技术，已经逐渐成为分析所有生物基因功能的有力工具。该技术结合蛋白荧光标记技术进行配体-受体结合试验，可明确上述4种CART候选受体是否为CART受体。这将为进一步了解生物体的生理调控机制以及疾病的预防、发生、治疗等多方面提供新的研究方向。

4 结论

通过对差异表达基因的筛选、亚细胞定位和α跨膜螺旋区预测最终获得了23个G蛋白偶联受体，对其结构功能进行分析，结合神经肽受体的特征，最终将AGTR2、HTR2B、S1PR1、S1PR2作为CART的候选受体。

[1]Sen A, Bettegowda A, Jimenezkrassel F, et al. Cocaine and amphetamine-regulated transcript(CART) regulation of follicle stimulating hormone signal transduction in bovine granulosa cells [J]. Endocrinology,2007,148(9):4400-4410.

[2]Kobayashi Y, Jimenez-krassel F, Li Q, et al. Evidence that cocaine-and amphetamine-regulated transcript is a novel intraovarian regulator of follicular atresia [J]. Endocrinology,2004,145(11):5373-5383.

[3]Kobayashi Y, Jimenez-Krassel F, Ireland J J, et al. Evidence of a local negative role for cocaine and amphetamine regulated transcript (CART), inhibins and low molecular weight insulin like growth factor binding proteins in regulation of granulose cell estradiol production during follicular waves in cattle [J]. Reprod Biol Endocrinol,2006,4(1):22-33.

[4]Sen A, Lv L, Bello N, et al. Cocaine-and amphetamine-regulated transcript (CART) accelerates the temination of FSH induced ERK1/2 and AKT activation by regulating the expression and degradation of specific mitogen-activated protein kinase phosphatases in bovine granulosa cells[J]. Mol Endocrinol,2008,22(12):2655-2676.

[5]Lv L, Jimenezkrassel F, Sen A, et al. Evidence for local inhibitory effect of the cocaine-and amphetamine-regulated transcript (CART) peptide on LH-induced thecal androstenedione production [J]. Biol Reprod,2007,77:179.

[6]Folger J K, Jimenezkrassel F, Ireland J J, et al. Regulation of granulosa cell cocaine and amphetamine regulated transcript (CART) binding and effect of CART signaling inhibitor on granulosa cell estradiol production during dominant follicle selection in cattle [J]. Biol Reprod,2013,89(6):137-144.

[7]Mustafina L J, Naumov V A, Pawel C, et al. AGTR2 gene polymorphism is associated with muscle fibre composition, athletic status and aerobic performance [J]. Experimental Physiology,2014,99(8):1042-1052.

[8]Zhou A,Dekker G A, Lumbers E R, et al. The association of AGTR2 polymorphisms with preeclampsia and uterine artery bilateral notching is modulated by maternal BMI [J]. Placenta,2013,34(1):75-81.

[9]Xue Q, Chen P, Li X, et al. Maternal high-fat diet causes a sex-dependent increase in AGTR2 expression and cardiac dysfunction in adult male rat offspring [J]. Biol Reprod,2015,93(2):49.

[10]Zhenping W, Yuping L, Bernard J J, et al. Skin mast cells protect mice against vaccinia virus by triggering mast cell receptor S1PR2 and releasing antimicrobial peptides [J]. J Immunol,2012,188(1):345-357.

[11]Laura B, Stéphane D, Jaakko K, et al. A population-specific HTR2B stop codon predisposes to severe impulsivity[J]. Nature,2010,468(7327):1061-1066.

[12]Priceman S, Shen S, Wang L, et al. S1PR1 is crucial for accumulation of regulatory T cells in tumors via STAT3 [J]. Cell Reports,2014,6(6):992-999.

[13]Skon C N, June-Yong L, Anderson K G, et al. Transcriptional downregulation of S1pr1 is required for the establishment of resident memory CD8+ T cells [J]. Nature Immunol,2013,14(12):1285-1293.

(编辑：武英耀)

Bovine follicular conine-and amphetamine-regulate transcript candidate receptors screening

Wang Kai1, Meng Jinzhu1, Li Pengfei2, Bi Xilin1, Jing Jiongjie1, Zhang Zining2, Lv Lihua1*

(1.CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine,ShanxiAgriculturalUniversity,Taigu030801，China; 2.CollegeofLifeScience,ShanxiAgriculturalUniversity,Taigu030801，China)

[Objective]This study was performed to screen the candidate receptors of Cocnine-and Amphetamine-Regulate Transcript(CART)of bovine follicles.[Methods]35325 expressed genes obtained from bovine follicular transcriptome after depth of sequencing were screened in this study, selecting out some genes that ODF1/ODF2 tending to infinity and the ratio between 1.5 to 2.0 to identify their gene symbol.Then NCBI and CELLULAR were used to identify subcellular localization, transmembrane helix software was also used in the prediction of transmembrane α helix region, screening out 7 α helix composed of transmembrane region of membrane protein and CART candidate receptor. [Results]Eventually, the 11 highly expressed genes were screened by differential gene expression,subcellular localization and transmembrane helix prediction. According to the structure and function of the screened 23 G protein-coupled receptor and neuropeptide receptor binding characteristics,we find four G-protein-coupled receptors as CART candidate receptors.[Conclusion]The AGTR2、HTR2B、S1PR1 and S1PR2 as CART candidate receptors ultimately,and laid a solid foundation for further study.

Bovine follicle， CART， Candidate receptor， Transmembrane helical， Expressed genes， G protein coupled-receptor

2016-11-05

2016-12-06

王锴(1992-)，男(汉)，山西寿阳人，硕士研究生，研究方向：动物生殖生理

*通信作者：吕丽华，教授，博士生导师，Tel: 0354-6288863；E-mail：lihualvsxau@126.com

国家自然基金(31172211)；山西省回国留学人员科研资助项目(2014-重点5)；山西省国际科技合作项目(201603D421006)；山西省三晋学者和人才引进项目；山西农业大学引进人才博士科研启动费(2014ZZ04);山西农业大学创新金项目(zdpy201403/201503)

S823

A

1671-8151(2017)04-0263-05