特异性下调LKB1的表达对肝癌细胞侵袭迁移能力的影响

沙 亮， 何剑波， 李科志， 陈 闯， 黄 山， 赵荫农， 连 芳， 邬国斌

(1 广西医科大学附属肿瘤医院 肝胆外科， 南宁 530021； 2 广西医科大学研究生院， 南宁 530021；3 广西医科大学基础医学院， 南宁 530021)

特异性下调LKB1的表达对肝癌细胞侵袭迁移能力的影响

沙 亮1,2， 何剑波1， 李科志1， 陈 闯1， 黄 山1， 赵荫农1， 连 芳3， 邬国斌1

(1 广西医科大学附属肿瘤医院 肝胆外科， 南宁 530021； 2 广西医科大学研究生院， 南宁 530021；3 广西医科大学基础医学院， 南宁 530021)

目的 研究特异性下调LKB1的表达对肝癌细胞系SK-hep-1迁移侵袭能力的影响。方法 Real-time PCR和Western Blot检测人肝癌细胞株和人正常肝细胞HL7702中LKB1表达情况。设计并合成LKB1特异性双链小干扰RNA(LKB1-siRNA)，转染到高表达LKB1的人肝癌细胞株SK-hep-1中靶向沉默LKB1基因表达，并设置阴性对照组(NC组)。Real-time PCR和Western Blot检测LKB1基因的mRNA水平与蛋白表达水平的变化。利用CCK-8法检测肝癌细胞增殖能力。通过体外Transwell小室基质侵袭和迁移实验，观察LKB1表达沉默后对人肝癌细胞株SK-hep-1侵袭迁移能力的影响。计量资料两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验。结果 与正常人肝细胞HL7702相比，LKB1基因和蛋白在人肝癌细胞SK-hep-1中高表达(P值均<0.05)。与NC组相比，siLKB1-1处理组SK-hep-1细胞中的LKB1基因和蛋白表达均明显降低(P值均<0.05)。与NC组相比，siLKB1-1转染的SK-hep-1细胞增殖速度明显加快、侵袭和迁移能力明显增强(1.393±0.022 vs 1.128±0.032、147±19 vs 83±21、113±13 vs 75±17；t值分别为15.313、14.879、8.791；P值均<0.001)。结论 LKB1有可能参与抑制肝癌增殖、侵袭迁移的过程并影响肝癌的预后。

癌， 肝细胞； LKB1； 细胞增殖； 肿瘤侵润； 细胞运动

LKB1(liver kinase B1)基因又名STK11(serine/thronine protein kinase 11)基因。是由433个氨基酸构成的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，分子量60 kD，包括激酶区域、N端调节域和C端调节域。LKB1在人体组织中广泛表达，且参与调控多种生物学过程，如细胞能量代谢、细胞周期、细胞增殖及细胞极性。LKB1胚系突变是导致黑色素斑-胃肠多发性息肉综合征(Peutz-Jeghers syndrome，PJS)的主要原因，PJS后期发生肿瘤的风险比健康人群要显著升高[1]。目前研究表明，LKB1作为一个抑癌基因在多种恶性肿瘤中呈低水平表达，如非小细胞肺癌[2]、乳腺癌[3]、胃癌[4]、胰腺癌[5]、肝癌[6]等。LKB1表达缺失时会破坏上皮细胞的极性而促进肿瘤进展、侵袭、转移[7]。在癌基因KrasG12D突变肺癌小鼠模型中，伴随LKB1的缺失会显著缩短肿瘤潜伏期，增加肿瘤负担，促进肺癌的侵袭和远处转移[8]。在乳腺癌中过表达LKB1能够显著抑制乳腺癌细胞的侵袭迁移及血管生成的过程[9]。同时发现LKB1高表达与乳腺癌的总生存期呈正相关[10]。此外，在肝癌患者中LKB1的低表达可能是一个不良的预后因子。本实验利用RNA干扰技术，以高表达LKB1蛋白的肝癌细胞株SK-hep-1为研究对象，针对LKB1基因沉默表达后探讨SK-hep-1细胞的生物学行为改变，为进一步研究肝癌的发病机制提供思路。

1 材料与方法

1.1 主要材料

1.1.1 细胞系 人正常肝细胞系HL7702、人肝癌细胞系SK-hep-1、HepG2、SSMC7704细胞来源于上海生命科学院细胞库，由本实验保存。

1.1.2 主要试剂 小鼠抗人LKB1单克隆抗体、兔抗人β-actin购自Cell Signaling Technology公司、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(H+L)抗体购自碧云天公司；DMEM培养基、FBS、胰酶购自Gibco公司；Lipofectamine2000、Trizol试剂购自Invitrogen公司。逆转录试剂盒、Real-time PCR试剂盒购自TOYOBO公司。BCA试剂盒购自凯基公司。

1.1.3 小干扰RNA(siRNA)基因序列的设计 由上海吉玛基因化学技术有限公司设计并合成3条特异性抑制LKB1基因表达的siRNA和1条无关对照序列(NC)。siRNA针对的LKB1目的序列见表1。将含有siRNA粉剂的EP管离心后利用附赠的DEPC水溶解为储存液，放置-20 ℃冰箱备用。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 人正常肝细胞系HL7702、人肝癌细胞SK-hep-1、HepG2、SSMC7704在含10%胎牛血清、青霉素(100 U/ml)和链霉素(100 μg/ml)的DMEM培养基中维持生长，细胞置于37 ℃，含5%CO2的培养箱中培养，当细胞融合度达到80%～90%时，用含有EDTA的胰蛋白酶进行消化，并以1∶3或1∶4的比例进行传代。

1.2.2 细胞转染 转染前24 h取对数生长期的SK-hep-1细胞消化计数，以3×105细胞/孔接种于6孔板中，当细胞融合度达到70%～90%时，按照Lipofectamine2000说明书进行转染。实验分为阴性对照组(NC)、实验组1(siLKB1-1)、实验组2(siLKB1-2)和实验组3(siLKB1-3)。为了检验转染效率，SK-hep-1细胞转染了FAM标记的siRNA,转染6 h后，更换培养基为完全培养基，并在荧光显微镜下观察转染效率。转染24 h后收集各组细胞进行后续实验。1.2.3 Real-time PCR检测LKB1 mRNA的表达水平 将转染48 h后的各组细胞采用Trisol试剂提取总RNA，核酸浓度检测仪测定其浓度和纯度，按照TOYOBO逆转录试剂盒说明书合成cDNA。引物序列见表1。按照TOYOBO Real-time PCR试剂盒操作步骤进行LKB1基因扩增并以β-actin作为内参进行实验，反应条件为95 ℃预变性1 min，95 ℃变性15 s，60 ℃退火并延伸45 s，共进行40个反应循环；反应结束建立溶解曲线。同一实验重复3次，实验数据分析采用2-△△CT法计算。

表1 siRNA及引物序列

1.2.4 Western Blot 检测细胞中LKB1蛋白的表达 将转染48 h后的各组细胞弃去培养液，用预冷PBS洗涤细胞3次，根据细胞数量加入适量的裂解液(按1∶100的比例加入蛋白酶抑制剂PMSF)，晃动混匀后置于冰上充分裂解细胞30 min，4 ℃、12000 r/min离心15 min,收集上清，获得细胞总蛋白。按照凯基BCA蛋白含量检测试剂盒说明书检测各组总蛋白含量。调整蛋白质样品浓度，使每孔蛋白质上样量为60 μg，聚丙烯酰胺凝胶电泳，电转移至聚偏氟乙烯膜，5%脱脂牛奶室温封闭2 h，封闭过后按照anti-LKB1(1∶100)、anti-β-actin(1∶1000)、4 ℃摇床孵育过夜，TBST洗膜4次，每次10 min，再分别与相应的辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育1 h，增强化学发光检测。

1.2.5 CCK-8法检测细胞的增殖曲线 将转染24 h后的各组细胞消化收集离心重悬，利用血细胞计数器计数各组细胞。以5000细胞/孔接种于96孔板中，每组设6个复孔。在细胞贴壁后24、48、72 h检测各组细胞的生长情况，每孔加入10 μl的CCK-8试剂，放置于细胞培养箱，2 h后上机检测每孔光密度(OD)值，绘制生长曲线。

1.2.6 细胞侵袭能力检测 将Matri-gel胶置于4 ℃过夜，用无血清预冷的DMEM培养基按1∶6稀释Matri-gel胶混匀，每孔60 μl均匀铺在24孔Transwell上室的聚碳酸脂膜上，37 ℃过夜。收集转染24 h后的各组细胞，消化用无血清培养基重悬细胞计数，按每孔1×105/200 μl接种于上室。将小室置于24孔板中，下室加入700 μl含10%胎牛血清的DMEM培养基，37 ℃、5%CO2培养24 h后取出小室，用棉签擦去上室未穿膜的细胞，PBS洗涤2次，700 μl甲醇固定30 min，吉姆萨染色液染色30 min，PBS洗涤干净，室温晾干。显微镜下取5个随机视野计数，计算平均值，每组重复2～3次。

1.2.7 细胞迁移能力检测 Transwell小室不铺Matri-gel胶，按细胞数目为每孔1×104/200 μl接种于上室，其余实验步骤同1.2.6节。

2 结果

2.1 LKB1在肝癌细胞系与正常肝细胞中的表达差异 采用Real-time PCR和Western Blot法检测细胞系中LKB1 mRNA和蛋白质的表达变化。结果显示相对于正常肝细胞HL7702，LKB1 mRNA在SK-hep-1细胞中的表达要显著高于肝癌细胞HepG2、SSMC7704(P<0.05)；LKB1 蛋白水平在SK-hep-1细胞中的表达也明显高于HepG2、SSMC7704、HL7702(P<0.05)(图1)。

图1 LKB1 mRNA和蛋白在肝癌细胞系与正常肝细胞中的表达情况 a: LKB1 mRNA表达情况。与肝癌细胞HepG2、SSMC7704比较，*P<0.05; b:Western Blot 检测LKB1蛋白表达情况

2.2 siRNA转染SK-hep-1细胞后LKB1 mRNA和蛋白水平表达情况 Real-time PCR法检测siRNA干扰LKB1基因后在mRNA水平的表达变化，结果显示，siLKB1-1处理组LKB1的mRNA表达相对NC组明显降低(P<0.05)。Western Blot 法检测siRNA干扰LKB1基因后蛋白水平的表达变化，结果显示，LKB1-1处理组LKB1的蛋白表达相对NC组明显降低(P<0.05)，说明细胞SK-hep-1中的LKB1基因被有效沉默，所以选择siLKB1-1来进行后续实验(图2)。

图2 SK-hep-1细胞转染LKB1-siRNA后LKB1 mRNA和蛋白表达情况 a:LKB1 mRNA的表达情况。与NC组比较，*P<0.05;b: LKB1蛋白表达情况

2.3 CCK-8检测细胞的生长 CCK-8检测细胞增殖的结果显示，与NC组相比，转染siLKB1-1后的SK-hep-1细胞增殖在72 h加快(1.393±0.022 vs 1.128±0.032)，差异具有统计学意义(t=15.313,P<0.001)(图3)。

图3 siLKB1-1转染后肝癌细胞的增殖能力变化与NC组比较，*P<0.001

2.4 下调LKB1后肝癌细胞迁移能力的变化 利用Transwell迁移实验检测特异性下调LKB1表达后SK-hep-1细胞迁移能力的变化，结果显示，与NC组相比，实验组细胞迁移数目增多(147±19 vs 83±21)，差异具有统计学意义(t=14.879,P<0.001)(图4)。

图4 siLKB1-1转染SK-hep-1细胞后对细胞迁移能力的影响(吉姆萨染色，×100)

2.5 下调LKB1后肝癌细胞侵袭能力的变化 显微镜下计数各组穿过基底膜的细胞数，并进行统计学分析，结果显示，与NC组相比，实验组穿过基底膜的细胞数增加(113±13 vs 75±17)，差异具有统计学意义(t=8.791，P<0.001)(图5)。

图5 siLKB1-1转染SK-hep-1细胞后对细胞侵袭能力的影响(吉姆萨染色，×100)

3 讨论

目前根治性手术切除仍是治疗原发性肝癌的主要方法[11]，但术后肝癌易复发转移的特点使得5年生存率仍不理想。由于肝癌发生过程隐匿，病情进展迅速，恶性程度高，早期症状不明显，致绝大部分患者就诊时已是肿瘤晚期或是出现了肝外转移，失去根治性手术切除的机会。虽然目前认为综合治疗肝癌可以发挥各自的优势，能够提高患者的预后[12]，但是肝癌易复发转移的特点也使得远期疗效欠佳。因此，深入研究肿瘤侵袭迁移的分子机制并探索有效的预防和治疗措施具有重要的临床意义。

肝癌和大多数肿瘤一样，是一个多因素、多步骤、多基因共同作用的结果，涉及肿瘤细胞的增殖、血管生成、侵袭、迁移等一系列生物学过程。LKB1作为一个抑癌基因，其编码产物为一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，通过自身磷酸化或者磷酸化下游底物发挥功能。有研究[13]表明，其在多种恶性肿瘤中表达缺失并参与恶性进展。在能量下降的情况下，LKB1作为AMPK的上游，能够磷酸化AMPK，从而激活AMPK，实现对mTOR活性的负性调控，并进一步影响肿瘤的进展。在胰腺癌的研究中，LKB1下调可能通过减少p53/p21依赖的生长抑制作用来促进胰腺导管腺癌的发生[5]。在乳腺癌细胞中过表达LKB1可能通过上调p21WAF/CIP1和下调Cyclin D1、Cyclin E的表达来抑制细胞增殖[10]。通过敲除小鼠LKB1基因，发现小鼠死于胚胎期，解剖发现血管发育异常，进一步发现敲除LKB1后血管内皮生长因子(VEGF)的表达明显上升，故推测LKB1可能通过下调VEGF发挥对肿瘤的抑制作用[14]。有研究[15]发现LKB1的失活突变通过mTOR-HIF-1α信号轴调控赖氨酰氧化酶表达上调，促进肺癌细胞的侵袭能力。有研究[16]表明，在胃癌中LKB1通过下调CD44的表达来抑制肿瘤的转移。在胆管细胞癌中，低表达LKB1通过调控Wnt/β-catenin来促进疾病的进展[17]。但LKB1在肝癌中的具体调节作用机制目前还不是十分明确。另有研究[18]表明，肝癌中低表达LKB1与该疾病的临床进展有密切关系，LKB1低表达的肝癌患者预后更差，提示LKB1的低表达可能是导致肝癌发生发展的机制之一。

RNA干扰是一种目前常用的基因沉默技术，利用小分子双链RNA高效、特异地阻断细胞内特定基因的表达，促使mRNA降解，进而诱导细胞表现出某种特定基因缺失的表型[19]。本实验通过针对LKB1基因有效干扰的siRNA，将其转染至高表达LKB1的肝癌细胞株SK-hep-1中沉默LKB1基因的表达，然后检测该细胞系体外生物学行为的改变，从而研究下调LKB1 表达后是否可以增强肝癌细胞的侵袭迁移能力。Transwell小室模型是用来研究体外肿瘤细胞侵袭迁移能力的经典实验方法，通过模拟肿瘤细胞降解细胞外基质和穿过基底膜的侵袭迁移过程。通过荧光定量PCR及蛋白印迹实验结果提示，LKB1 mRNA及蛋白表达水平均明显受到抑制，说明转染siRNA后成功沉默了LKB1在细胞中的表达，为后续实验提供了实验模型。然后通过CCK-8法检验了沉默LKB1后SK-hep-1细胞的增殖能力。通过Transwell小室侵袭、迁移模型检验了沉默LKB1后SK-hep-1细胞的侵袭、迁移能力。结果发现，与NC组相比，下调LKB1基因的表达后SK-hep-1细胞的增殖、侵袭、迁移能力均明显增强，说明LKB1作为一个抑癌基因，其低表达与肝癌的恶性生物学行为有关。但是，LKB1基因在肝癌发生发展中起到的作用及调控恶性生物学行为中的作用机制及详细调控网络,还有待进一步实验去探究阐明。

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引证本文：SHA L, HE JB, LI KZ, et al. Influence of specific down-regulation of LKB1 expression on invasion and migration of hepatoma cells[J]. J Clin Hepatol, 2017, 33(5)： 875-879. (in Chinese) 沙亮, 何剑波, 李科志, 等. 特异性下调LKB1的表达对肝癌细胞侵袭迁移能力的影响[J]. 临床肝胆病杂志, 2017, 33(5): 875-879.

(本文编辑：朱 晶)

Influence of specific down-regulation of LKB1 expression on invasion and migration of hepatoma cells

SHALiang,HEJianbo,LIKezhi,etal.

(DepartmentofHepatobiliarySurgery,TheAffiliatedTumorHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China)

Objective To investigate the influence of specific down-regulation of LKB1 expression on invasion and migration of the hepatoma cell line SK-hep-1. Methods Quantitative real-time PCR (RT-PCR) and Western blot were used to measure the expression of LKB1 in the human hepatoma cell line SK-hep-1 and normal hepatocytes (HL7702). LKB1 specific double-strand small interfering RNA was designed, synthesized, and then transfected into the human hepatoma cell line SK-hep-1 with high expression of LKB1 to silence the expression of LKB1 gene. A negative control (NC) group was established. RT-PCR and Western blot were used to measure the changes in the mRNA and protein expression of LKB1. Cell Counting Kit-8 was used to measure the proliferative capacity of hepatoma cells. In vitro Transwell chamber invasion and migration assays were used to observe the influence of LKB1 gene silencing on invasion and migration of the human hepatoma cell line SK-hep-1. Thet-test was used for comparison of continuous data between two groups; a one-way analysis of variance was used for comparison between multiple groups, and the least significant differencet-test was used for further comparison between any two groups. Results Compared with normal human hepatocytes (HL7702), SK-hep-1 cells had significantly higher mRNA and protein expression of LKB1 (bothP<0.05). Compared with the NC group, the siLKB1-1 treatment group had significant reductions in the mRNA and protein expression of LKB1 in SK-hep-1 cells (bothP<0.05). Compared with the NC group, the siLKB1-1 treatment group had a significantly higher cell proliferation rate and significant increases in invasion and migration (1.393±0.022 vs 1.1284±0.032,t=15.313,P<0.001; 147±19 vs 83±21,t=14.879,P<0.001; 113±13 vs 75±17,t=8.791,P<0.001). Conclusion LKB1 may be involved in inhibiting the proliferation, invasion, and migration of hepatoma cells and can affect the prognosis of patients with liver cancer.

carcinoma, hepatocellular； liver kinase b1； cell proliferation； neoplasm invasiveness； cell movement

10.3969/j.issn.1001-5256.2017.05.016

2017-01-16；

2017-03-09。

国家自然科学基金资助项目(81460426)；国家自然科学基金资助项目 (81360315)；广西自然科学基金资助项目 (2014GXNSFAA118191)

沙亮(1990-)，男，主要从事肝胆肿瘤方面的研究。

邬国斌，电子信箱: gb.wu@139.com。

R735.7

A

1001-5256(2017)05-0875-05