HBV相关肝细胞癌肿瘤组织中热休克蛋白mRNA表达水平与肿瘤分期的相关性分析

徐庆年， 陆云飞， 汤伯宗， 陈晓蓉， 杨宗国

(上海市公共卫生临床中心， 上海 201508)

HBV相关肝细胞癌肿瘤组织中热休克蛋白mRNA表达水平与肿瘤分期的相关性分析

徐庆年， 陆云飞， 汤伯宗， 陈晓蓉， 杨宗国

(上海市公共卫生临床中心， 上海 201508)

目的 分析肝细胞癌(HCC)肿瘤组织中热休克蛋白(HSP)mRNA表达水平与HCC肿瘤分期的相关性。方法 从NCBI网站的基因表达数据库(GEO)下载GSE14520数据集。从GSE14520基因数据库中获取HSP基因25种，通过与数据库下载的临床资料比对，纳入具有HSP基因 mRNA表达水平和有对应临床资料的220例HCC患者。提取220例患者癌组织HSP基因的mRNA表达水平及对应的TNM分期及BCLC分期并进行相关性分析。采用Kruskal-WallisH非参数检验进行多组间比较，采用单因素及多因素logistic回归分析HSP与HCC肿瘤分期的相关性。结果 HSPA12A、HSPA5、HSP90AA1与HSPA13 mRNA随着TNM分期增高，表达逐渐升高(P值均<0.05)；HSP90AA1 mRNA随着BCLC分期增高，表达逐渐升高(P<0.05)。HSPA4L(OR=1.019，P=0.005)、HSPA12A(OR=1.077，P=0.026)与HSP90AA1(OR=1.001，P=0.002)是影响TNM分期的危险因素；HSPA9 mRNA升高与HCC患者TNM分期呈负相关(OR=0.995，P=0.011)。HSPH1(OR=1.005，P=0.041)、HSPA1B(OR=1.002，P=0.048)与HSPA5(OR=1.000，P=0.001)是影响BCLC分期的危险因素；HSPA9 mRNA升高与肝癌BCLC分期呈负相关(OR=0.995，P=0.005)。结论 HSP与HCC患者肿瘤临床分期存在一定相关性。

热休克蛋白质类； 癌, 肝细胞； 肿瘤分期； 回归分析

热休克蛋白(heat shock protein，HSP)作为分子伴侣在细胞的生长发育、代谢分化、基因转录、维持组织细胞的自稳和环境适应性方面发挥重要作用。研究发现肿瘤细胞的增殖、分化及转移均有大量的HSP参与，表明HSP与细胞的转化和恶变过程密切相关[1-2]。笔者前期研究结果发现，肝细胞癌(HCC)是HSP70和HSP90α高表达的肿瘤，细胞内HSP70和HSP90α表达增加与肿瘤发生、发展、预后有关，可能是HCC发展恶化的重要标志[2-3]。随着HSP与HCC相互关系研究的不断深入，HSP在HCC生物治疗中将发挥越来越重要的作用。HCC肿瘤临床分期与其治疗选择和预后密切相关[4]，本研究利用基因表达数据库(gene expression omnibus, GEO)中GSE14520基因表达样本，对肿瘤组织中HSP mRNA表达水平与HCC肿瘤临床分期进行分析，评价二者的相关性。

1 材料与方法

1.1 公共数据库资料获取 从NCBI网站的GEO(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)下载GSE14520数据集。GSE14520包含2个芯片平台，分别是Affymetrix HT Human Genome U133A Array (GPL3921)和Affymetrix HT Human Genome U133A 2.0 Array (GPL571)。应用GPL3921和GPL571平台检测HCC组织的病例数分别为220例和22例。RNA样品经过生物素标记与芯片杂交，采用GeneChip scanner 3000扫描，应用GCOS1.0软件进行初步分析。

1.2 研究对象 242例HCC患者的肝癌组织及配对的癌旁组织均来自于复旦大学附属中山医院肝癌研究所，所有患者均具有慢性HBV感染史或乙型肝炎肝硬化史。HCC诊断由2位病理学医师根据临床信息及病理学特征独立完成。用TRIzol提取肝癌及癌旁组织的总mRNA，质检合格后用于上述芯片的检测[5]。1.3 HSP筛选及临床资料匹配 从GSE14520基因数据库中获取HSP基因25种，通过与数据库下载的临床资料比对，22例样本因无对应的临床资料被剔除，最终纳入具有HSP基因的mRNA表达水平和有对应临床资料的220例HCC患者。提取220例患者癌组织HSP基因的mRNA表达水平，及对应的TNM分期及BCLC分期进行相关性分析。TNM分期根据国际抗癌联盟2002年发布的标准[6]，BCLC分期根据1999年Llovet等报道的标准[7]。

2 结果

2.1 不同TNM分期HCC患者肿瘤组织中HSP mRNA表达水平 在HCC患者中，肿瘤组织HSPA12A、HSPA2、HSPA5、HSP90AA1、HSPA13和HSPA14 mRNA表达在不同TNM分期间存在差异(P值均<0.05)，其中HSPA12A、HSPA5、HSP90AA1与HSPA13 mRNA随着TNM分期增高，表达逐渐升高(表1)。2.2 不同BCLC分期HCC患者肿瘤组织中HSP mRNA表达水平 HCC患者中，HSPA4L、HSPA5、HSP90AA1与HSPA14 mRNA表达在不同BCLC分期间存在差异(P值均<0.05)，其中HSP90AA1 mRNA表达水平随着BCLC分期增高，表达逐渐升高(表2)。

2.3 HSP mRNA表达水平对HBV-HCC患者TNM分期的影响 将HCC肿瘤TNM分期转化为二分类变量，TNM Ⅰ～Ⅱ期与TNM Ⅲ期。logistic单因素分析显示，肿瘤组织中HSPH1、HSPA4L、HSPA12A、HSPA5、HSPA9及HSP90AA1可能与HCC患者TNM分期有关(P值均<0.10)；将上述HSP利用Forward LR法纳入logistic多因素分析，结果显示，HSPA4L(OR=1.019，P=0.005)、HSPA12A(OR=1.077，P=0.026)与HSP90AA1(OR=1.001，P=0.002)是影响TNM分期的危险因素；HSPA9升高与HCC患者TNM分期呈负相关(OR=0.995，P=0.011)(表3)。

2.4 HSP mRNA表达水平对HBV-HCC患者BCLC分期的影响 将HCC肿瘤BCLC分期转化为二分类变量，肝癌早期(BCLC 0～A期)与肝癌中晚期(BCLC B～C期)。logistic单因素分析显示，肿瘤组织中HSPH1、HSPA4L、HSPA1A、HSPA1B、HSPA5、HSPA9及HSP90AA1可能与HCC患者BCLC分期有关(P值均<0.10)；将上述HSP利用Forward LR法纳入logistic多因素分析，结果显示，HSPH1(OR=1.005，P=0.041)、HSPA1B(OR=1.002，P=0.048)与HSPA5(OR=1.000，P=0.001)是影响BCLC分期的危险因素；HSPA9升高与肝癌BCLC分期呈负相关(OR=0.995，P=0.005)(表4)。

表1 不同TNM分期HBV-HCC患者HSP mRNA表达水平比较

3 讨论

已有大量研究证实，肿瘤细胞的增殖、分化及转移等过程均有大量的HSP参与[8-10]。HSP能与多种癌基因产物结合形成异源性蛋白复合体，介导癌蛋白构象成熟及转运，从而参与细胞转化过程。其中HSP70是HSP中最保守、最重要的一族，在大多数生物中含量最多，在应激反应中最敏感，因而是HSP中最受关注、研究最深入的一种[2,11]。另外，HSP90家族与肿瘤关系密切，在一些癌基因及其产物诱发的转化细胞和许多肿瘤细胞中HSP90表达增高[12-13]。HSP70和HSP90在HCC中高表达，参与肿瘤细胞的增生与凋亡，与肝癌的发生发展、生物学行为及预后有着密切的关系[2-3,11]。

本研究发现，肿瘤组织中HSP70家族(HSPA12A、HSPA5与HSPA13)在HCC患者不同TNM分期中存在表达差异，且随着TNM分期增高，表达逐渐升高。HSP70作为分子伴侣参与肿瘤细胞的功能代谢，保护肿瘤细胞免受有害因素的影响。HSP70在肿瘤细胞异于正常细胞的定位分布，在某种程度上反映了细胞生物学行为的异常。通过logistic回归进一步分析发现，HSP70家族中HSPA4L、HSPA12A、HSPA1B及HSPA5表达水平升高是肿瘤TNM分期或BCLC分期升高的危险因子。笔者的前期研究[2-3]发现，HSP70表达与HCC临床病理学特征存在一定的相关性，并对肿瘤增生及多发结节等因素具有一定的预测价值，可能为HCC治疗靶点及预后预测因子。另有学者[14-15]认为，HCC中HSP70表达随着组织学分级增高而增高，在HBV相关的HCC中有HSP70的过度表达和自发性细胞凋亡，癌细胞分化程度越低，恶性程度越高，HSP70表达水平越高，细胞凋亡越明显，因而HSP70可能为肝癌细胞恶性程度和预后的重要指标。

表2 不同BCLC分期HBV-HCC患者HSP mRNA表达水平比较

表3 HSP mRNA表达水平对HBV-HCC患者TNM分期的影响

表4 HSP mRNA表达水平对HBV-HCC患者BCLC分期的影响

根据是否含有谷氨酰胺的片段，HSP90可分为HSP90α(HSP90AA1)和HSP90β两种，两者同源性高达84%。在病毒转化和化学诱导的肿瘤细胞中，HSP90α表达水平明显升高，而HSP90β基本不变[12]。多项研究[16-17]表明，HSP90α在肝癌患者血浆及血清中的表达明显高于健康对照者。而免疫组化同样发现HSP90α在肝癌组织中表达明显高于癌旁组织[18]。本研究的分析发现，肿瘤组织中HSP90α在HCC患者不同TNM分期及BCLC分期中存在表达差异，且随着TNM分期及BCLC分期增高，其表达逐渐升高。通过logistic回归进一步分析HSP90α与HCC肿瘤分期的关系，结果发现，HSP90α升高一定程度上提示HCC患者TNM分期较高。研究表明，HSP90α可促进细胞迁移并通过调节细胞周期促进细胞增殖。肿瘤细胞尤其依赖HSP90α生存于氧含量低、营养缺乏的微环境，HSP90α可作为一种正向调节因子参与血管再生[19-21]。HSP90α是肝癌组织转移的重要基因[20]，与本研究中HSP90α与HCC患者TNM分期有相关性的结果是一致的。原发性肝癌患者血清HSP90α与肝癌肿瘤分化程度、肿瘤大小显著相关，HSP90α阴性患者预后显著优于HSP90α阳性患者，术后平均无瘤生存期前者38.6个月、后者25.5个月(P<0.05)，提示HSP90α可作为判断原发性肝癌的临床分期及预后的指标[17,22]。另外，由于HSP90α在维持多种肿瘤蛋白的正常结构、功能和稳定性中的重要作用，它已被认为是肿瘤治疗的新靶点[21]。HSP90α作为抗肿瘤药物作用的新靶点，其抑制剂可特异性结合HSP90α， 从而阻断HSP90α介导的肿瘤细胞的增殖与转移的信号传导通路，达到抑制肿瘤的目的[20,23]。基于HSP90α与HCC临床病理学的密切关系，关于其在HCC发生、发展、预后及治疗中的作用需要进一步深入研究。

本研究中logistic分析显示，作为HSP70家族中的一员，HSPA9与TNM分期及BCLC分期呈负相关。然而已有研究[24]显示，HSPA9过表达可促进细胞增殖，延长细胞生命周期，并在肿瘤细胞中表达上调。另外，过表达HSPA9可显著降低凋亡蛋白介导的HepG2肿瘤细胞凋亡[25]。在临床相关性分析中，HSPA9蛋白表达升高与HCC肿瘤分期升高及血管侵犯有关，具有HCC转移瘤表型的细胞系中同样发现有HSPA9 mRNA的高表达。而且，HSPA9高表达与HCC肿瘤转移及早期复发有关[26]。罗旭等[27]研究发现，HSPA9对HCC侵袭转移起促进作用。以上研究结果与本研究中结果不一致性。笔者通过检索HSPA9的基因功能，发现HSPA9可控制细胞增生。鉴于本研究基于GEO数据库分析，统计过程中未考虑其他临床病理学特征，可能是导致研究结果与大部分已有的报道不一致的原因，有关HSPA9与HCC患者肿瘤分期的相关性尚需进一步研究证实。

综上，本研究采用GEO数据库资料进行数据分析，结论存在一定局限性，部分研究结果与已发表的文献存在不一致性。另外，HCC为多基因疾病，其发生发展影响因素众多，本文仅分析了肿瘤组织中HSP表达与肿瘤临床分期的相关性。因此，关于HSP家族成员在HCC发生发展中的作用仍值得进一步深入研究。

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引证本文：XU QN, LU YF, TANG BZ, et al. Correlation between mRNA expression of heat shock protein in tumor tissue and tumor stage in patients with HBV-related hepatocellular carcinoma[J]. J Clin Hepatol, 2017, 33(5): 869-874. (in Chinese) 徐庆年， 陆云飞， 汤伯宗， 等. HBV相关肝细胞癌肿瘤组织中热休克蛋白mRNA表达水平与肿瘤分期的相关性分析[J]. 临床肝胆病杂志, 2017, 33(5): 869-874.

(本文编辑：刘晓红)

Correlation between mRNA expression of heat shock protein in tumor tissue and tumor stage in patients with HBV-related hepatocellular carcinoma

XUQingnian,LUYunfei,TANGBozong,etal.

(ShanghaiPublicHealthClinicalCenter,Shanghai201508,China)

Objective To investigate the correlation between mRNA expression of heat shock protein (HSP) and tumor stage in patients with HBV-related hepatocellular carcinoma (HCC). Methods The GSE14520 data set was downloaded from gene expression omnibus in the website of the National Center of Biotechnology Information. A total of 25 HSP genes were obtained from the GSE14520 data, and after the comparison with the clinical data downloaded from the database, 220 HCC patients with mRNA expression of HSP and corresponding clinical data were enrolled. The mRNA expression of HSP in tumor tissues was measured, the TNM stage and Barcelona Clinic Liver Cancer (BCLC) stage were determined for each patient, and a correlation analysis was performed. The Kruskal-Wallis H non-parametric test was used for comparison between multiple groups, and univariate and multivariate logistic regression analyses were used to investigate the correlation between HSP and HCC tumor stage. Results With the increase in TNM stage, the expression of HSPA12A, HSPA5, HSP90AA1, and HSPA13 gradually increased (allP<0.05), while the expression of HSP90AA1 gradually increased with the increase in BCLC stage (P<0.05). HSPA4L (OR=1.019,P=0.005), HSPA12A (OR=1.077,P=0.026), and HSP90AA1 (OR=1.001,P=0.002) were risk factors for TNM stage. HSPA9 was negatively correlated with TNM stage (OR=0.995,P=0.011). HSPH1 (OR=1.005,P=0.041), HSPA1B (OR=1.002,P=0.048), and HSPA5 (OR=1.000,P=0.001) were risk factors for BCLC stage, and HSPA9 was negatively correlated with BCLC stage (OR=0.995,P=0.005). Conclusion There is a certain correlation between HSPs and tumor stage in HCC patients. Key words：heat-shock proteins； carcinoma, hepatocellular； neoplasm staging; regression analysis

10.3969/j.issn.1001-5256.2017.05.015

2016-11-07；

2016-12-23。

上海市卫生和计划生育委员会中医药科研专项课题(2016LP028)；2015年上海市青年医师培养资助计划

徐庆年(1968-)，男，副主任医师，主要研究中西医结合防治急慢性肝胆疾病。

杨宗国，电子信箱: dr_yangzg@aliyun.com。

R735.7

A

1001-5256(2017)05-0869-06