环介导等温扩增技术联合结核分枝杆菌快速培养在涂阴肺结核中的诊断价值

陶峰　顾超　张齐

[摘要] 目的 探讨环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification method，LAMP，新型的核酸扩增技术）联合结核分枝杆菌快速培养（BACTEC MGIT 960，结核分枝杆菌检测仪）在痰涂片阴性肺结核中的诊断价值。 方法 收集疑似肺结核患者90例，随机分成A、B、C组，A组通过指南推荐涂阴肺结核诊断，B组通过LAMP确诊，C组通过LAMP联合BACTEC MGIT 960确诊，并给予抗结核治疗2个月后随访所有入组患者胸部CT变化情况，分别比较涂阴肺结核诊断方法，LAMP及LAMP联合BACTEC MGIT 960的诊断可靠性。 结果 涂阴肺结核指南推荐诊断阳性率40.0%，LAMP阳性率53.3%，联合检测阳性率60.0%，差异无统计学意义。联合检测敏感性88.9%，特异性91.7%均明显升高。 结论 在实际临床中，环介导等温扩增技术联合结核分枝杆菌快速培养（BACTEC MGIT 960）在痰涂片阴性肺结核诊断中特异性及敏感性高。

[关键词] 环介导等温扩增技术；BACTEC MGIT 960；涂阴肺结核；诊断

[中图分类号] R446.5；R521 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2017）05-0019-04

目前每年结核病在全球的发病率仍以1%的速度增长，而结核分枝杆菌的耐药性也在增加，中国作为结核病高发的国家，应该提升结核病诊治技术，才可提升诊治结核病的效率[1]。然而，在2010年期间，经第五次全国结核病流行病学抽样调查，结果表明2010年15岁以及以上人群中，发生活动性肺结核发病率达到459/10万比例，而其中涂阳肺结核患病发病率也达到66/10万比例[2]。尽管活动性肺结核及涂阳肺结核的患病率逐年下降，但是总体下降幅度不大，其中一部分原因是菌阴肺结核，Singh M等[3]研究结果表明涂阴肺结核的接触者被感染的几率在7.3%～21.0%，其传染性低于痰培养阳性的肺结核。

尽管肺结核的诊断方法日益增多，针对涂阴肺结核的诊断标准也越来越多，但是仍缺少特异性、敏感性高的有效诊断方法。目前结核病诊断研究比较多的主要是LAMP[4]和BACTEC MGIT 960[5]。本研究主要通过比较涂阴肺结核指南组、LAMP组及LAMP联合BACTEC MGIT 960检测组考虑肺结核患者抗结核治疗2个月后，所有阳性及阴性疑似肺結核患者各30例随访胸部CT，观察2个月后所有患者胸部CT病灶变化情况，评价环介导等温扩增技术联合结核分枝杆菌快速培养在涂阴肺结核中的诊断价值。

1 资料与方法

1.1一般资料

2015年1～12月于嘉兴市第一医院收集符合标准的影像学疑似肺结核疾病患者，随机从中抽取90例疑似肺结核疾病患者入组研究。临床疑似肺结核疾病患者症状包含：出现慢性咳嗽、连续3周咳痰以及咳痰伴咯血症状，胸部CT检查可见阴影。纳入标准：（1）肺部CT或X线检查疑似肺结核者；（2）3次痰涂片未见抗酸杆菌者；（3）肺部影像学异常且有结核临床症状者；（4）既往无结核病史者；（5）年龄>16岁；（6）意识清醒者；（7）知情同意者。排除标准：（1）排除肺部疾病已诊断明确者；（2）排除存在影响凝血机制疾病者，如血友病、尿毒症、重症肝炎、血小板<50×109/L等；（3）排除1周内使用抗凝药物者，如低分子肝素、华法令、阿司匹林、氯吡格雷等；（4）排除精神病及神智障碍患者；（5）年龄<16岁者；严重高血压、3个月内心梗患者、严重心肺功能不全者；（6）病情危重不能坚持试验过程者。最终纳入90例疑似肺结核患者。90例疑似肺结核患者随机双盲法分为A组、B组、C组，各30例。A组以指南推荐涂阴结核诊断标准诊断，B组通过LAMP诊断，C组通过LAMP联合BACTEC MGIT 960诊断疾病。A组患者男15例，女15例，年龄>16岁，平均年龄（38.0±5.2）岁；B组患者男14例，女16例，年龄>16岁，平均年龄（35.0±7.1）岁；C组患者男15例，女15例，年龄>16岁，平均年龄（36.0±6.3）岁；三组患者资料对比不存在统计差异（P>0.05），具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 临床诊断涂阴肺结核的标准[6] 临床诊断中必须具备的诊断指标：（1）临床诊断中，至少在3份痰标本的涂片镜检中，得出抗酸杆菌为阴性；（2）临床经胸部X线及胸部CT诊断，符合活动性肺结核病变；（3）在临床中，排除患其他非结核性肺部疾病；（4）经病理检查，证实肺部出现结核性改变；（5）应用支气管肺泡灌洗液（BALF）检验，检出支气管以及肺部组织含有抗酸杆菌。临床诊断中的辅助诊断指标：（1）对患者在临床中进行结核菌素（PPD 5TU）皮肤试验，结果为强阳性；（2）进行血清抗结核抗体检验，结果呈阳性；（3）应用PCR加探针检测痰结核分枝杆菌，结果呈阳性；（4）对患者进行病理检查，证实出现肺外组织结核病变。

1.2.2 LAMP 检测肺结核疾病 制备DNA 模板：可以将获取的患者痰标本处理液，转移到1.5 mL EP管内。然后，设置12 000 r/min转速高速离心5 min。之后去除上清液，洗涤2次得到的缓冲液，并加入适量的DNA提取液。最后，将液体混匀后，进行沸水浴10 min，再瞬时离心，将得到的上清液转移到另外一只准备好的EP管中，作为检验模板。

进行LAMP检测操作：可以根据相关文献[7]中的方法，应用gyrB基因进行检验，可以选用gyrB内6个区段的4种引物作为本次检验肺结核疾病的LAMP引物，主要如下所示：

外引物为：F3：5'-ACCACGGAATACGACTTCGA-3'，B3：5'-AGTGAAAGGTGCGGCTCT-3'；内引物为： FIP：5'-GGTCACCCTCTCGTCGGTCAGCAAGAGATGGC-GTTCCTC-3'，BIP：5'-GAAGTGGTCAGCGACGTCGCTAACTTTGTGCGGTGCAGTG-3'。

而在具体进行实验操作中，需要严格按照说明书进行检验。其实际反应体系内，可以将dNTP、（NH4）2SO4、MgSO4、KCl、Tris-HCl、甜菜碱、TritionX-100、FIP、BIP、F3以及聚合酶等放置到反应管内，并加水確保总液体为25 μL，在65℃环境内使其反应1 h。在反应结束之后，观察反应管的颜色变化。若在实际中产生特异性片段，则扩增产物将会和染料结合，从而形成绿色荧光，反之，反应管颜色仍为橙色，并不会发生颜色变化。

1.2.3 BACTEC MGIT 960仪器 检验中应用BACTEC MGIT 960 全自动仪器（美国 BD 公司）。配套试剂：MGIT OADC营养添加剂、MGIT培养管、PANTA杂菌抑制剂。具体检测方法：在无菌条件下，将MGITPANTA/OADC混合液（0.8 mL）加入MGIT培养管内备用。送检标本进行常规去污染浓缩处理之后，将送检标本接种到12B培养瓶与MGIT培养管中，并将MGIT培养管置入BACTEC MGIT 960仪器内培育。若有阳性标本，则仪器的红色指示灯将会闪亮且伴有报警提示音。此时，可以按仪器的提示步骤，依次取出阳性标本。将阳性标本从培养管内取出，直接对阳性标本涂片进行抗酸染色，培养6周，以确定阳性标本是否是分枝杆菌。

1.2.4 诊断结果 针对最终的诊断结果，对肺结核患者治疗2个月后，随访进行胸部CT，从而考虑明确给出诊断结果。

1.3 统计学方法

采用SSPS20.0统计学软件计算，计数资料以率%表示，采用χ2检验，P<0.05表示差异有统计学意义。

2结果

2.1不同方法临床诊断结果比较

传统涂阴肺结核诊断方法符合涂阴肺结核阳性率40.0%（12/30），1例经BALF检出抗酸分枝杆菌，1例肺穿刺病理符合，10例通过诊断标准符合涂阴肺结核诊断，12例患者均给予抗结核治疗，所有患者2个月后随访胸部CT，胸部CT病灶吸收9例。LAMP检测法检测阳性率53.3%（16/30），最终胸部CT吸收13例。LAMP联合BACTEC MGIT 960检测阳性率60.0%（18/30），最终胸部吸收16例。

2.2三种方法阳性率比较

见表1。LAMP联合BACTEC MGIT 960诊断涂阴肺结核检测阳性率高于单独LAMP检测，高于涂阴肺结核诊断标准诊断的阳性率，但差异无统计学意义（P>0.05）。考虑本研究收集病例数较少，因此差异无统计学意义，如果加大样本量，统计学可能有差异。

2.3三种方法敏感性和特异性比较

见表2。LAMP联合BACTEC MGIT 960诊断涂阴肺结核的敏感性和特异性均高于LAMP及涂阴肺结核诊断指南。联合诊断减少了假阴性及假阳性的结果，有利于涂阴肺结核的诊断。

2.4 检测及治疗过程中不良反应

三种方法检测过程中未见明显不良反应，患者均能耐受。BACTEC MGIT 960在本研究未见污染标本出现。抗结核治疗患者5例出现肝功能损失，3例出现消化道症状，但给予对症处理后症状均好转，其余患者均能耐受。

3讨论

在我国临床疾病检测中，一直都将结核病列为重大传染病检测范围，并且也充分认识到该病的危害，强化临床疾病检测工作，可早诊断、早治疗呼吸道结核病。尽管近年来传染性肺结核患病率下降明显，但是涂阴肺结核发病率明显升高。在Cowie等[8]研究中，针对随机抽取的152例结核病患者研究发现，在患者肺尖部有活动性结核病变，对患者进行结核菌素试验以及痰液涂片直接检查，得出针对被观察152例患者中，在未来的65个月内将会有88例患者发展成阳性肺结核。因此如何有效诊断涂阴肺结核将对结核病的防治起到关键的作用。

目前涂阴肺结核传统诊断方法存在敏感性、特异性低的缺陷，改良罗氏培养方法更加可靠，但临床检测疾病的阳性率低[9-13]。而在许家琏等[14]研究中指出，改良罗氏培养方法在检测涂阴肺结核中，其阳性检出率是12.86%，且耗时长，往往需2个月之久。BACTEC MGIT 960 检测系统能将报告时间缩短。也有相关报道中指出，在BACTEC MGIT 960 检测中，可将非结核杆菌阳性检出率的时间缩短到7 d以内，并且还可以使分离培养得出的阳性检测结果比常规培养检出率高出10%。彭亦平等[15]研究发现初治涂阴培阳率13.78%。而林健雄等[16]研究发现BACTEC MGIT 960检测结核分枝杆菌痰标本阳性率54.02%，而本研究阳性率60.0%，考虑本研究通过严格的标准纳入疑似涂阴肺结核患者，故阳性率有差异。

在1989年期间，Hanee首次报道指出，临床中可以应用PCR检测观察结核分枝杆菌，从而Hanee开创应用分子生物学技术在临床中诊断结核病的新起点，缺点是由于探针技术等操作程序比较复杂、费用较贵。近年来因环介导等温扩增LAMP诊断技术的出现，给疑似疾病患者早期诊断带来新的曙光。这是一种新的基因诊断技术，它具有简单、快速、特异性强的特点。江勇等[17]报道LAMP法的灵敏度为92.9%，特异性为98.0%，阳性预测值为94.5%。刘毅等[18]报道LAMP敏感性92.16%，特异性87.14%。而本研究LAMP敏感性为81.3%，特异性为78.6%，考虑本研究主要检测涂阴患者，故其敏感性等指标较江勇[17]及刘毅等[18]研究的指标低。

同时本研究联合LAMP及BACTEC MGIT 960方法检测，其阳性率、敏感性及特异性均高于传统指南方法诊断及单独LAMP检测[19-21]。因此两者联合有利于涂阴肺结核的检测，同时指导抗结核用药，有利于治疗和预防。两种方法联合检测对结核病的诊断和防治有着极其重要的意义，值得临床推广。目前本研究的样本例数较少，三组阳性率比较无统计学差异，有待加大样本量，提高数据可靠性。

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（收稿日期：2016-12-17）