内生枯草芽孢杆菌BS35发酵的优化配方实验

李晓舟

SAS（StatisticalAnalysisSystem）软件是可完成统计分析、运筹问题等大量模块的集成软件系统。借助SAS软件可方便地定量分析各因素对发酵实验结果的影响，使优化后的工艺科学性强、重现性好、可信度高。其中Plackett-Burman设计法（诸因素内重要因子的筛选方法）采用两水平的试验设计，用最少的试验次数尽可能精确估计因素中的主效果，可在众多的考察因素中快速有效地筛选出最为重要的几个因素。可选择可信度大于90%（或85%）的因素作为重要因素进行下一步试验，与目前常用的部分因子实验和随机平衡实验相比，该方法最为高效、准确。根据Plackett-Burman设计的结果，从众因素中筛选出重要因子，以原浓度为基础，以一定浓度为梯度进行最陡爬坡实验，从而确定重要因子的浓度范围。响应面分析法（RSA）是综合试验分析和数学建模最经济合理的实验设计，是一种寻找多因素系统中最佳条件的数学统计方法。弥补了以前在微生物培养基优化方面的不足，是近年来应用最多的一种优化技术。Placket-Burman法和响应面分析法已被成功地运用于微生物发酵条件的优化研究中。Konyaetal（1998）采用RSA和最速增长途径法来研究培养基最佳浓度，提高康帕汀产率62%，而工作量比常规实验减少40%左右。Ismail（1999）、张丽霞（2006）、曹小红（2007）、周波（2008）、牛芳方（2009）等在研究发酵生产中成功地应用了Plackett-Burman设计法及RSA，高效快速地获得了优化工艺。

本研究的目的是通过优化发酵培养基配方，提高发酵液中的菌体数量和芽孢含量，降低生产成本，提高生产效率为大规模工业化生产奠定基础。

1.材料和方法

1.1 供试菌株

枯草芽孢杆菌BacillussubtilisBS35。

1.2 液体种子液制备

BS35经过LB平板活化后，挑取单菌落，接种于液体LB培养基中，于29℃、140rpm培养16h。

1.3 培养基

参照刘林、张丽霞（2006）枯草芽孢杆菌发酵培养基配方

1号发酵培养基：黄豆粉49.5g，玉米粉25.3g，酵母浸粉，K2HPO41.1g，MgSO40.1g，CaCl20.1g，MnSO41.5g，蒸馏水1000ml，pH8.0；

2号发酵培养基：玉米粉3g，黄豆粉3g，葡萄糖0.5g，MnSO42g，K2HPO43g，KH2PO41.5g蒸馏水1000ml，pH8.0；

3号发酵培养基：玉米粉1.0g，黄豆粉30.0g，MnSO41.0g，K2HPO43g，KH2PO41.5g，葡萄糖15.0g，硫酸镁0.5g，酵母浸粉0.2g，氯化铁0.1g，碳酸钙0.1g，蒸馏水1000ml，pH8.0；

4号发酵培养基：葡萄糖50.0g，黄豆粉30.0g，酵母浸粉10.0g，碳酸钙7.0g，蒸馏水1000ml，pH8.0；

5号发酵培养基：玉米粉10.0g，葡萄糖5.0g，黄豆粉15.0g，碳酸钙5.0g，硫酸胺1.0g，磷酸氢二钾0.3g，硫酸镁·7H2O，硫酸锰·H2O0.2g蒸馏水1000ml，pH8.0；

6号发酵培养基：玉米粉3.0g，葡萄糖3.0g，黄豆粉3.0g，蛋白胨10.0g，NaCl5.0g，MgSO4.7H2O0.4g，硫酸亚铁0.02g，蒸馏水1000ml，pH8.0；

7号发酵培养基：葡萄糖10.0g，玉米粉20.0g，黄豆粉15.0g，硫酸锰0.1g，硫酸镁0.1g，碳酸钙2.0g，酵母浸粉3.0g，硫酸亚铁0.02g，磷酸氢二钾2.0g，蒸馏水1000ml，pH8.0；

8号发酵培养基：玉米粉5.0g，葡萄糖3.0g，豆饼粉5.0g，鱼粉3.0g，蒸馏水1000ml，pH8.0；

9号发酵培养基：玉米粉46.0g，豆饼粉35.0g，葡萄糖1.0g，K2HPO43.2g，MgSO4·7H2O0.1g，蒸馏水1000ml，pH8.0；

10号发酵培养基：玉米粉10.0g，葡萄糖5.0g，豆饼粉15.0g，鱼粉5.0g，CaCO35.0g，（NH4）2SO41.0g，K2HPO40.3g，MgSO4·7H2O0.2g，MnSO4·H2O0.2g，蒸馏水1000ml，pH8.0；

1.4芽孢染色法

芽孢染色：孔雀绿染色法，按革兰氏染色涂片后，加孔雀绿染色液3-4滴，用木荚夹住载玻片，在火焰上加热，使有蒸汽产生，但勿使沸腾，如此反复染色10min。在染色中，依据蒸发情况随时添加染色液或水，使涂面上保持不干。用清水冲洗约半分钟，至无多余染色液流下为止。用2%番红染色3min，水洗，晾干。镜检。芽孢呈绿色，菌体和芽孢囊呈微红色。

1.5含菌量测定

将已培养42h的发酵培养液进行梯度稀释，取100μl在LB平板培养基上涂板，24h后记录菌落数量，计算cfu/ml。

1.6芽孢形成率

以染色后显微镜下观察计算，一个视野中100个细胞中芽孢的数量。芽孢形成率=（芽孢的数量/100）×100%

1.7发酵条件

250ml三角瓶中按100ml培养基的装液量，调其初始pH值到8.0，以6%的接菌量接种子培养液，于29℃、140rpm振荡培养。

1.8培养基配方优化设计方案

通过Plackett-Burman设计法对初始发酵基础培养基中各种成份的影响效应进行评价，筛选出有显著影响效应的因素，然后利用最陡爬坡路径实验逼近重要因素的最适浓度范围，确定后续实验中心点，再通过响应分析法（ResponseSurfaceAnalysis，RSA）确定最佳发酵配方，最后进行模型验证。

1.8.1Plackett-Burman设计法筛选培养基中重要因子：应用Plackett-Burman设计法全面考察初始发酵基础培养液中6个成分的影响效应，筛选培养基中影响发酵液含菌量的重要因子。在SAS软件中调出实验设计表格，各因子设置高低两水平，低水平为初始发酵基础培养基各成分的浓度，高水平为低水平的1.5倍。Plackett-Burman实验因素及水平列表（g/L）

1.8.2 最陡爬坡实验接近最大响应面区域：由Plackett-Burman实验回归分析确定重要因素，根据试验结果进行数据分析得出各因素的t值和可信度，一般选择可信度大于90%或85%以上的因素作为重要因素，并根据这些因素对发酵液活菌数的正影响（T值为正）或负影响（T值为负）设计最陡爬坡路径实验，增加或减少重要因素在培养基中的浓度，其余因素均取低水平即初始发酵基础培养液的浓度，考察发酵液中菌体数的变化趋势，确定重要因素的最适浓度范围。

1.8.3响应面分析试验设计筛选重要因素的最优浓度水平：根據Plackett-Burman实验确定了影响芽孢形成数量的重要因素，再以最陡爬坡实验确定接近响应值区域的重要因素的浓度，运用Box-Behnken法进行响应面分析实验，确定重要因素的水平。