不同裂解方式对微生物DNA提取的影响

凌云++王晶++王越菲+彭自然

摘要：分子生物学试验中的细胞裂解及DNA提取是试验的第1步，但是由于细胞种类多样、细胞壁成分复杂，DNA提取的效果容易受到提取方法的影响。针对以上问题，主要研究溶菌酶、蛋白酶K、十二烷基磺酸钠（sodium dodecyl sulfate，简称SDS）、十六烷基三甲基溴化铵（hexadecyl trimethyl ammonium bromide，简称CTAB）等4种化学方法对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌以及大肠杆菌3种代表性细菌细胞的裂解效果。结果表明：溶菌酶+SDS法对3种微生物的裂解效果都不错，但可能造成蛋白质污染且DNA碎片较多；溶菌酶+热冻法对于金黄色葡萄球菌、大肠杆菌的裂解效果较好且蛋白质污染较少；蛋白酶K+CTAB法仅对金黄色葡萄球菌的裂解提取效果较好；溶菌酶+蛋白酶K法的提取效果最差。在试验中可以根据需要选择不同的裂解方式，从而达到操作性、重现性及经济性的统一。

关键词：微生物细胞裂解；DNA提取；溶菌酶法；混合法；热冻法

中图分类号： S182；Q933文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2016）12-0061-03

收稿日期：2015-10-22

[JP2]基金项目：水体污染控制与治理科技重大专项（编号：2014ZX07101-012-04）。

作者简介：凌云（1978—），男，浙江湖州人，博士，副教授，主要研究方向为微生物生态学。Tel：（021）61900431；E-mail：yling@shou.edu.cn。

通信作者：彭自然，硕士，讲师，主要研究方向为环境化学。Tel：（021）61900431；E-mail：zrpeng@shou.edu.cn。

由于细胞壁结构的不同，细菌可分为革兰氏阳性菌（G+）、革兰氏阴性菌（G-）[1]。革兰氏阳性菌的细胞壁主要成分是肽聚糖，其上附有磷壁酸；革兰氏阴性菌的细胞壁分为内壁层、外壁层，内壁层由肽聚糖组成，外壁层主要由脂多糖、蛋白质组成。细胞破碎的方法有很多[2]，有机械法（如珠磨法、高压匀浆法、超声波法）和非机械法（如溶酶法、渗透压冲击、干燥法、化学渗透法）。由于提取细胞内物质如DNA、RNA、活性物质等多数需要将细胞破碎，而机械法容易导致DNA断裂，因此相关报道更多地集中在使用有机溶剂、抗生素、表面活性剂、螯合剂、变性剂等化学试剂进行细胞破碎[3-5]。本试验以金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌3种实验室常用细菌为研究对象，采用溶菌酶、蛋白酶K、十二烷基磺酸钠（sodium dodecyl sulfate，简称SDS）、十六烷基三甲基溴化铵（hexadecyl trimethyl ammonium bromide，简称CTAB）等4种常见化学试剂的不同组合对其细胞进行裂解，通过结合提取裂解后细胞破碎所释放出DNA的效果，比较这些方法对不同类型细菌的裂解效果，尝试寻找适合的方法，以期为细胞裂解及提取DNA的研究提供一定的参考。

1材料与方法

1.1试验菌株

试验所用菌株为笔者所在实验室中原有冷藏保存的金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、大肠杆菌（Bacillus coli）。

[HTK]1.2試验试剂[HT]

试验中所用到的主要试剂有三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（简称Tris-HCl）、乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，简称EDTA）、CTAB、SDS、NaCl、NaAc、蛋白酶K、溶菌酶、无水乙醇、溶菌酶、酚、三氯甲烷、异戊醇、异丙醇等。

1.3试验仪器

试验中所用的主要仪器：DNP-9052型电热恒温培养箱、DK-S22型电热恒温水浴锅，上海精宏实验设备有限公司；RJ-TGL-16G台式离心机，无锡市瑞江分析仪器有限公司；DYY-6C型电泳仪，北京市六一仪器厂；BioPhotometer生物分光光度计，德国艾本德（Eppendorf）股份公司；Biostep凝胶成像分析系统，德国Biostep公司。

1.4试验方法

将枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌接种于放有培养基并已灭菌的培养皿中，于25 ℃培养箱中培养24 h，并按相应方法裂解细菌细胞并提取DNA。所用培养基为上海疾控华康科技开发公司生产的营养琼脂，其主要成分为蛋白胨、牛肉膏粉、氯化钠、琼脂粉，pH值为7.3±0.2。

1.4.1方法1（溶菌酶+蛋白酶K法）参照刘晓侠等的方法[6]并稍作改动：将菌体用500 μL TE（10 mmol/L Tris-HCl，pH值8.0；1 mmol/L EDTA，pH值8.0）重悬于2 mL离心管中，加入10 μL 20 mg/mL溶菌酶，37 ℃水浴20 min；加入2.5 μL 20 mg/mL蛋白酶K混匀，37 ℃水浴1 h。

1.4.2方法2（溶菌酶+SDS法）参照陈敏的方法[7]并稍作改动：将菌体用100 μL TE、50 μL 20 mg/mL溶菌酶重悬于2 mL离心管中，于37 ℃水浴1 h；加入10 μL 10% SDS，混匀后于室温放置5 min；加入66 μL NaCl（5 mmol/L），混匀后于12 000 r/min离心10 min。

1.4.3方法3（溶菌酶+热冻法）参照宋培勇的方法[8]并稍作改动：将菌体置于2 mL离心管中，加入150 μL裂解液Ⅰ（0.15 mol/L NaCl，0.1 mol/L EDTA，pH值8.0）、150 μL 20 mg/mL 溶菌酶，混匀后于37 ℃水浴2 h；加入200 μL裂解[JP2]液Ⅱ（0.1 mol/L NaCl，0.5 mol/L Tris-HCl，10% SDS，pH值80），反复冻融（冰浴5 min与沸水浴5 min交替进行各3次），于8 000 r/min离心15 min，取上清液于1支新离心管中。

1.4.4方法4（蛋白酶K+CTAB法）参照刘敏等的方法[9]并稍作改动：将菌体用500 μL TE重悬于2 mL离心管中，加入50 μL 10% SDS、20 μL 20 mg/mL蛋白酶K，混匀后于 37 ℃ 水浴1 h；加入200 μL 5 mol/L NaCl，充分混匀；加入100 μL CTAB-NaCl溶液（0.7 mol/L NaCl，10% CTAB），混匀后于65 ℃水浴1 h。

1.5裂解效果的检验

通过对裂解后提取到的DNA浓度、纯度以及琼脂糖凝胶电泳检测来评估各种方法裂解细菌细胞的效果。

1.5.1DNA的浓度与纯度检测取10 μL DNA，稀释20倍，测定其D260 nm、D280 nm，通过D260 nm/D280 nm值来检测所提取DNA的纯度。根据以下公式来检测所提取的DNA浓度：

[JZ]DNA浓度（μg/mL）=50×D260nm×稀释倍数。

D260 nm=1，相当于约50 μg/mL双链DNA。通常情况下纯DNA样品D260 nm/D280 nm值约为1.8；若D260 nm/D280 nm值>1.9，可能有RNA污染；若D260 nm/D280 nm值<1.8，可能有蛋白质污染[10]。

1.5.2琼脂糖凝胶电泳检测将提取得到的DNA进行琼脂糖凝胶电泳，电泳时间约为45 min，电泳完毕后用紫外凝胶成像系统进行成像分析和拍照。

2结果与分析

2.1DNA纯度与浓度

由表1可见，方法1对于金黄色葡萄球菌、大肠杆菌的D260 nm、D280 nm相近且效果相对较好，D260 nm/D280 nm值高于1.8，但低于1.9，表明DNA浓度较高且几乎不存在RNA污染；但是枯草芽孢杆菌的D260 nm、D280 nm都相对较低，说明释放出的DNA与蛋白质相对较少，D260 nm/D280 nm值高于1.9，说明其中有RNA污染。

方法2对试验细菌细胞的裂解非常充分，相對于其他方法，所获得的DNA产量最高，DNA浓度也最大，但同时蛋白质产率也最高。推测原因为该方法中加入大量溶菌酶并使用SDS，但未使用蛋白酶；该方法对于大肠杆菌的提取效果不如其他2种菌，其D260 nm/D280 nm值只有1.55，远远低于一般纯度DNA的D260 nm/D280 nm值，虽然有大量DNA，但也因存在过多蛋白质而造成污染。

在方法3中，有2种细菌D260 nm/D280 nm值高于1.9，表明存在RNA污染；相对于其他2种菌，大肠杆菌的D260 nm/D280 nm值为1.87，所得到的DNA纯度相对较好；3种菌中枯草芽孢杆菌的D260 nm、D280 nm均低于金黄色葡萄球菌、大肠杆菌，表明释放出的DNA、蛋白质都相对较少。

在方法4中，金黄色葡萄球菌的D260 nm、D280 nm均比其他2种菌高，所释放出的DNA、蛋白质都较多，因而虽然DNA浓度相对较高，但D260 nm/D280 nm值只有1.58，远低于1.8，存在较多蛋白质污染。与之前3种方法相比，用方法4来裂解金黄色葡萄球菌细胞并提取DNA的效率较低，而用该方法提取的枯草芽孢杆菌，D260 nm/D280 nm值高于1.9，表明存在RNA污染。

如果以方法归类，从提取的DNA量来看，对于金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌这3种细菌而言，方法2（溶菌酶+SDS）提取得到的3种细菌的DNA的量都明显大于方法1、方法3、方法4所提取的3种细菌的DNA量（P<0.05）；同时，方法2（溶菌酶+SDS盐）最终提取的DNA质量浓度也明显高于方法1、方法3、方法4所提取的3种细菌的DNA浓度（P<0.05）。

2.2细菌细胞形态差异对提取结果的影响

由表2可见，金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌同为革兰氏阳性菌（G+），根据查阅的资料[1]，革兰氏阳性菌对于溶菌酶比较敏感，革兰氏阴性菌则相对不敏感，因此溶菌酶对革兰氏阳性菌裂解效果应较好。但从实际结果比较来看，枯草芽孢杆菌效果明显较差。有的细菌在其生活史的一定阶段，于所影响的细胞内形成1个圆形、椭圆形或柱形的结构，称为芽孢[1]，因此推测此时正值枯草芽孢杆菌存在芽孢的阶段，而芽孢对外界不良环境具有很强的抵抗能力，因此大大影响了裂解效果，释放出的DNA量也就相对较少。而属于革兰氏阴性菌的大肠杆菌裂解效果与金黄色葡萄球菌相近，应是溶菌酶的浓度比较高的原因造成的，实际所用浓度为相关报道[6]中的2倍。

大量高浓度的溶菌酶使得方法2的裂解效果大大优于原文献中提到的裂解效果[9]，再加上SDS分离蛋白质的作用，使该方法成为所有方法中裂解效果最好的，但是将通常与SDS搭配使用的蛋白酶K换成了溶菌酶，大量分离出来的蛋白质得不到充分降解，使得蛋白质的含量也是4种方法中最高的。同时，革兰氏阳性菌对于溶菌酶较革兰氏阴性菌敏感的特点在该方法中得到体现。

在方法3中，冻融作用极冷极热的急速温度变化对细菌细胞壁和细胞膜的破坏作用也是比较强的，这点从金黄色葡萄球菌和大肠杆菌裂解所释放出的DNA量能看出，但是对枯草芽孢杆菌不甚理想，推测为其中芽孢的作用。芽孢尤其能耐高温，同时也能抵抗低温，在-190 ℃的液氮中保存6个月仍能存活[1]，在进行该方法的试验时一些细菌胞内已形成的芽孢抵御了温度对于细胞的杀伤以及部分化学试剂的破坏。

方法4适用于大多数微生物细胞的裂解和DNA提取[6]，但相对于其他2种菌，对溶菌酶敏感且又不含有芽孢的金黄色葡萄球菌显然裂解效果更好。在抽提时，金黄色葡萄球菌的上清液更易被吸取，而其他2种菌的上清液则相对浓稠，难以吸取。正因为如此，金黄色葡萄球菌在试验过程中容易将蛋白质一并吸取上来，造成蛋白质的污染；而其他2种菌却是因为上清液吸取的不充分导致DNA提取量的减少，影响对裂解效果的评估。

2.3琼脂糖凝胶电泳结果分析

将细胞裂解后提取得到的DNA进行琼脂糖凝胶电泳的结果如图1所示，可见1～24泳道各组呈现不同的亮度，表明4种方法对于4种细菌都可提取出DNA，但DNA的浓度、含量及片段分布不尽相同，其中3、4，5、6，7、8，9、10，11、12，15、16，17、18，21、22，23、24泳道带相对于其他泳道更亮，说明相对于其他几个样，它们中所含的DNA片段量是较高的，特别是7～12泳道所属的方法2，该方法作用的3种细菌都释放出较大量的DNA片段，与5、6，17、18泳道相对比也略显得有些暗淡，说明该方法所提取DNA片段断裂最少，对于23与24泳道而言亦是如此。而5、6，15、16，17、18，21、22泳道较同样提取方法中的泳道条带更亮且更规则，表明样品DNA浓度较大且片段较完整。综合比较条带亮度及其片段分布情况，5、6，15、16，17、18，21、22泳道，即方法1的大肠杆菌、方法3的枯草芽孢杆菌、方法3的大肠杆菌以及方法4的枯草芽孢杆菌提取效果较好，此外方法2就总体效果而言也较好。

[FK（W17][TP凌云1.tif]

3讨论与结论

评价一种DNA提取方法优劣的主要依据是DNA是否量多、纯度好、片段足够完整以及能否准确反映样品中微生物种群的多样性[10]。仅从DNA浓度与纯度看，本研究方法1对于金黄色葡萄球菌与大肠杆菌裂解效果较好；方法2对于3种细菌效果都不错，但对于大肠杆菌提取的DNA含量较其他2种菌有些偏低；方法3对于金黄色葡萄球菌与大肠杆菌相对来说效果较明显；在方法4中，金黄色葡萄球菌的裂解提取效果最佳。但如果结合电泳图并考虑提取的DNA量多而且片段也相对较大，适合进一步进行其他研究的话，则本试验中最适合金黄色葡萄球菌的裂解提取DNA的方法为方法2，最适合枯草芽孢杆菌裂解提取DNA的方法为方法3，最适合大肠杆菌裂解提取DNA的方法为方法3。此外，方法2（溶菌酶+SDS）在本试验中裂解获得DNA的量是最多的，在有关文献中也证实该方法既简便效果又较理想[11]，但从本试验来看，DNA高释放率的同时也存在大量蛋白质造成污染，以及少量的RNA，因此该方法若进一步改进，可加入蛋白酶K及少量RNA水解酶，减少污染、提高提取的DNA浓度，则该方法将进一步成为4种方法中最优最有效率的方法。而且，过夜等步骤使得试验时间加长，这样DNA容易出现降解和断裂的现象[12]，因此，应尽量寻求试验所需时间更短的方法，最大限度地减少提取的DNA片段的再次断裂、降解。另外，根据所查阅的部分文献[13-14]，也可考虑增加PCR扩增这一步骤，通过对PCR产物的检验，不但能使试验结果的显著性进一步提[CM（25]高，也可检验各种方法所提取的DNA是否适于进行PCR[CM）]

扩增。

[HS2][HT8.5H]参考文献：[HT8.SS]

[1][ZK（#]王家玲，李顺鹏，黄正. 环境微生物学[M]. 2版.北京：高等教育出版社，2004：16-17.

[2]修志龙，姜炜，苏志国. 细胞破碎技术的研究进展和发展方向[J]. 化工进展，1994（1）：15-21.

[3]Novella I S，Fargues C，Grévillot G. Improvement of extraction of penicilln acylase from E. coil cells by a combined use of chemical methods[J]. Biotechnology and Bioengineering，1994，44（3）：379-382.

[4]Falconer R J，ONeill B K，Middelberg A P J. Chemical treatment of Escherichia coli：1.extraction of intracellular protein from uninduced cells[J]. Biotechnology and Bioengineering，1997，53（5）：453-458.

[5]Hettwer D，Wang H. Protein releases from Escherichia coli cell permeabilized with guanidine-HCl and Triton X100[J]. Biotechnology and Bioengineering，1989，33（7）：886-895.

[6]劉晓侠，林建平，岑沛霖. 微生物基因组DNA提取方法的比较与改进[J]. 嘉兴学院学报，2007，19（3）：48-50.

[7]陈敏. 土壤样品中DNA提取方法的比较[J]. 微生物学杂志，2005，25（3）：101-104.[HJ1.7mm]

[8]宋培勇. 从土壤中提取DNA方法比较[J]. 微生物学杂志，2006，26（1）：109-112.

[9]刘敏，谢利波，乐超银. 金黄色葡萄球菌DNA提取方法的研究[J]. 实用医学进修杂志，2007，35（2）：123-125.

[10][ZK（#]曲艳玲，廖永红，汪苹，等. 不同细胞裂解方法提取活性污泥总DNA研究[J]. 北京工商大学学报：自然科学版，2007，25（2）：13-16.

[11]Bourrain M，Achouak W，Urbain V，et al. DNA extraction from activated sludges[J]. Current Microbiology，1999，38（6）：315-319.

[12]宫强，关道明，王耀兵，等. 大肠杆菌总DNA快速提取方法的比较研究[J]. 海洋环境科学，2005，24（4）：63-66.

[13]杨建，洪葵. 红树林土壤总DNA不同提取方式比较研究[J]. 生物技术通报，2006（增刊）：366-371

[14]苏俊峰，马放，侯宁，等. 活性污泥总DNA不同提取方法的比较[J]. 生态环境，2007，16（1）：47-49.