Cyclin D1与claudin7联合检测在肾上皮性肿瘤鉴别诊断中的价值

刘 燕，赵 鹏，于文娟，王 强，陈云庆，邹玉伟，李玉军，张 伟

不同组织类型的肾肿瘤形态学上有重叠，彼此之间易混淆。研究表明，肾肿瘤的病理组织分型具有重要的预后意义[1-2]，因此准确的病理诊断及鉴别诊断非常重要。目前用于辅助诊断和鉴别诊断肾肿瘤的免疫组化抗体种类繁多，但特异性和敏感性报道不一，为进一步丰富肾肿瘤的免疫组化诊断谱，本实验应用组织芯片及免疫组化技术检测常见不同组织类型肾肿瘤中Cyclin D1和claudin7的表达，探讨两种抗体对肾肿瘤鉴别诊断的应用价值。

1 材料与方法

1.1病例来源收集青岛大学附属医院和解放军第401医院2010年1月～2015年12月连续性肾肿瘤358例，所有病例均由两名以上经验丰富的病理专科医师重新阅片，最终明确诊断、无异议的肾肿瘤326例，包括肾嗜酸细胞瘤(renal oncocytoma, RO)62例、透明细胞肾细胞癌(clear cell renal cell carcinoma, CCRCC)147例、嫌色细胞癌(chromophobe renal cell carcinoma, ChRCC)51例、乳头状肾癌(papillary renal cell carcinoma, PRCC)35例、透明细胞管状乳头状肾癌(clear cell tubulopapillary renal cell carcinoma, CCTPRCC)16例和Xp11.2易位/TFE3基因融合相关性肾癌15例。另选取20例肿瘤旁肾组织作为对照，分析正常肾组织中两种抗体的表达。

1.2方法对所有病例的HE切片进行形态学观察，镜下将所需的典型病变区域用油性笔标记，然后将该切片和石蜡组织块进行比较，依靠HE切片上的标记在石蜡组织块上的同一部位也做一标记；利用组织芯片制作仪(Tissue Arrayer，Beecher Instrument, USA)的钻孔芯针在供体蜡块穿取直径为1.5 mm的组织芯，依次插入到受体蜡块中，制成组织芯片蜡块。用切片机对组织芯片蜡块3 μm厚连续切片，对组织微阵列中的每个组织片逐一在显微镜下进行仔细观察与比对，结果成功构建309例，17例不合格标本被除外。空位Maker选用扁桃体组织，位于芯片的一角。

1.3免疫组化染色各组病例均行Cyclin D1(鼠抗人单克隆，SP4，1 ∶100，Spring公司)和claudin7(兔抗人多克隆，1 ∶200，Abcam公司)免疫组化染色，同批次设阳性对照和阴性对照。免疫组化染色采用EnVision两步法，在Roche BenchMark XT全自动免疫组化机上进行。

1.4结果判定Cyclin D1阳性表达于肿瘤细胞核，而claudin7表达于细胞膜和(或)胞质，呈棕黄色细颗粒状。按阳性细胞所占百分比并参考着色强度确定分级如下：无明显阳性细胞为阴性(-)，阳性细胞数<25%为弱阳性(1+)，25%～50%为中度阳性(2+)，>50%为强阳性(3+)。

1.5统计学处理采用SPSS 13.0软件进行统计分析，应用χ2检验及Fisher检验分析比较Cyclin D1和claudin7在不同类型肾肿瘤中的表达，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1CyclinD1和claudin7在肿瘤旁肾组织中的表达20例肿瘤旁肾组织中，仅2例显示Cyclin D1在肾小管及肾小球毛细血管散在阳性；而claudin7在肾远端小管和集合管恒定细胞膜阳性，6例同时伴有近端小管胞质阳性。

2.2CyclinD1在不同类型肾肿瘤中的表达Cyclin D1在RO和ChRCC中的阳性率分别为86.2%(50/58)和8.2%(4/49)，前者均为中等以上阳性(22例2+，28例3+)；CCRCC(70.0%，98/140)、CCTPRCC(71.4%，10/14)和Xp11.2易位性肾细胞癌(42.9%，6/14)中均有不同程度表达；34例PRCC中仅有3例阳性，均表现为散在或灶状阳性。统计学分析显示，Cyclin D1在RO与ChRCC、RO与PRCC、CCRCC与ChRCC、PRCC与Xp11.2易位性肾细胞癌中的表达相比，组间差异均有统计学意义(P<0.05，表1，图1)。

2.3claudin7在不同类型肾肿瘤中的表达49例ChRCC中43例细胞膜阳性(87.8%)，其中35例中等以上阳性(17例2+，18例3+)；58例RO中12例阳性(20.7%，10例2+，2例3+)，但均定位于胞质；34例PRCC中17例阳性(50.0%，14例定位于胞膜，3例定位于胞质)，其中15例表现为中等以上阳性；14例CCTPRCC中8例(57.1%)阳性，均定位于细胞膜；而在CCRCC和Xp11.2易位性肾细胞癌中很少表达，阳性率分别为8.6%(12/140)和14.3%(2/14)。统计分析结果显示，ChRCC与RO，CCRCC与ChRCC、CCTPRCC，PRCC与Xp11.2易位性肾细胞癌相比，各组间差异均具有统计学意义(P均<0.05，表2，图2)。

表1 Cyclin D1在常见肾肿瘤中的表达

RO.肾嗜酸细胞瘤；ChRCC.嫌色细胞癌；CCRCC.透明细胞肾细胞癌；PRCC.乳头状肾癌；Xp11.2.Xp11.2易位性肾细胞癌；CCTPRCC.透明细胞管状乳头状肾癌; RO与ChRCC相比，χ2=64.72，P<0.000 1；RO与PRCC相比，χ2=52.56,P<0.000 1; CCRCC与ChRCC相比，χ2=55.87，P<0.000 1；PRCC与Xp11.2易位性肾细胞癌相比，χ2=4.28，P<0.05

表2 claudin7在常见肾肿瘤中的表达

RO.肾嗜酸细胞瘤；ChRCC.嫌色细胞癌；CCRCC.透明细胞肾细胞癌；PRCC.乳头状肾癌；Xp11.2.Xp11.2基因易位性肾细胞癌；CCTPRCC.透明细胞管状乳头状肾癌；RO与ChRCC相比，χ2=47.82，P<0.000 1；CCRCC与ChRCC相比，χ2=11.30，P<0.000 1；CCRCC与CCTPRCC相比，χ2=26.57，P<0.000 1；PRCC与Xp11.2易位性肾细胞癌相比，χ2=45.29，P<0.05

2.4CyclinD1和claudin7联合应用在不同类型肾肿瘤中的表达58例RO中40例(69.0%)表现为Cyclin D1阳性/claudin7阴性，而Cyclin D1阴性/claudin7阳性仅2例(3.4%)；49例ChRCC中41例(83.7%)表现为Cyclin D1阴性/claudin7阳性，而Cyclin D1阳性/claudin7阴性仅2例(4.9%)，在RO和ChRCC的鉴别中，Cyclin D1阳性/claudin7阴性此种免疫表型对于RO的敏感性和特异性分别为69.0%和95.9%，而Cyclin D1阴性/claudin7阳性对ChRCC诊断的敏感性和特异性分别为83.7%和96.6%；CCRCC主要表现为Cyclin D1阳性/claudin7阴性(92/140，65.7%)，其次为Cyclin D1阴性/claudin7阴性(36/140，25.7%)；14例CCTPRCC中有6例Cyclin D1阳性/claudin7阳性、4例Cyclin D1阳性/claudin7阴性，在CCRCC和CCTPRCC的鉴别中，Cyclin D1阳性/claudin7阴性此种免疫表型对于CCRCC的敏感性和特异性分别为65.7%和71.4%，而Cyclin D1阳性/claudin7阳性对CCTPRCC诊断的敏感性和特异性分别为42.9%和95%。PRCC中有17例表现为Cyclin D1阴性/claudin7阴性，其次14例为Cyclin D1阴性/claudin7阳性；14例Xp11.2易位性肾细胞癌中有8例Cyclin D1阴性/claudin7阴性、4例Cyclin D1阳性/claudin7阳性(表3)。

①A①B①C①D②A②B②C②D

图1A.Cyclin D1在嗜酸细胞瘤中弥漫强阳性；B.Cyclin D1在嫌色细胞癌中阴性；C.Cyclin D1在透明细胞肾细胞癌中弥漫强阳性；D.Cyclin D1在透明乳头状肾细胞癌中弥漫强阳性，EnVision两步法图2A.claudin7在肾嗜酸细胞瘤中阴性；B.claudin7在肾嫌色细胞癌中弥漫强阳性膜表达；C.claudin7在乳头状肾癌中弥漫强阳性膜表达；D.claudin7在透明细胞乳头状肾癌中弥漫强阳性膜表达，EnVision两步法

3 讨论

肾肿瘤是一类异质性很高的肿瘤，不同肿瘤之间细胞形态可非常相似，如诸多肿瘤均可以表现为透明细胞或嗜酸细胞等，单纯依靠形态学有时很难鉴别，免疫组化染色具有重要的辅助作用。有关Cyclin D1和claudin7联合检测在大宗肾肿瘤病例中的研究报道较少，现就两者在常见肾肿瘤中的表达以及应用价值进行讨论。

表3 Cyclin D1和claudin7联合检测在不同肾肿瘤中的表达

RO.肾嗜酸细胞瘤；ChRCC.嫌色细胞癌；CCRCC.透明细胞肾细胞癌；PRCC.乳头状肾癌；Xp11.2.Xp11.2基因易位性肾细胞癌；CCTPRCC.透明细胞管状乳头状肾癌

Cyclin D1为细胞周期蛋白家族中的重要成员之一，在细胞周期G1/S转换中发挥重要的正性调控作用，其含量随细胞周期而呈周期性变化。正常组织中Cyclin D1表达量很少甚至不表达，而在乳腺癌[3]、非小细胞肺癌[4]、甲状腺乳头状癌[5]等许多恶性肿瘤中存在蛋白过表达现象。Cyclin D1高表达可能与基因改变(包括染色体易位、基因扩增和基因组多态性)、转录后调控、翻译后蛋白稳定等多种机制有关[6]。claudin7是claudins家族成员之一，claudin蛋白属于紧密连接蛋白家族，是上皮细胞间紧密连接的主要结构之一，迄今已发现有24个亚型[7]。Cyclin D1在肿瘤旁肾组织中很少表达，本组20例中仅2例见肾小管上皮细胞及肾小球的毛细血管内皮细胞散在阳性。而claudin7主要在肾远端肾小管和集合管中表达，不同节段的肾小管claudin7阳性表达定位不同(胞膜或胞质)，推测可能与肾小管的渗透功能状态有关。

本组实验发现，Cyclin D1和claudin7在RO和ChRCC中的表达差异有显著性。Cyclin D1在86.2%的RO中阳性(50/58，均为中等以上阳性)，而ChRCC中仅有8.2%(4/49)阳性，差异有统计学意义(P<0.01)。相反，claudin7在RO中很少表达(20.7%，12/58)，且均表现为胞质阳性，而ChRCC中的阳性率为87.8%(43/49)，均为中到强的细胞膜着色，两者之间相比差异有统计学意义(P<0.000 1)。统计分析显示，Cyclin D1阳性/claudin7阴性对于RO的敏感性和特异性分别为69.0%和95.9%，而Cyclin D1阴性/claudin7阳性对ChRCC的敏感性和特异性分别为83.7%和96.6%。Sukov等[8]应用免疫组化及FISH技术检测63例RO和36例ChRCC中Cyclin D1蛋白的表达及CCND1基因重排，结果发现，所有ChRCC(0/36)均无Cyclin D1过表达及CCND1基因异常，然而33%(21/63)的RO存在Cyclin D1过表达，其中13例(62%)出现CCND1分离信号，42例无Cyclin D1过表达的病例中仅1例出现CCND1分离信号。关于Cyclin D1在RO中过表达的机制目前尚不清楚，一些个案报道和小宗病例研究发现部分RO出现染色体11q13上的CCND1基因易位，推测是导致Cyclin D1过表达的原因[9-10]。然而，部分RO免疫组化Cyclin D1过表达的病例，经FISH证实并无CCND1基因重排，表明Cyclin D1在RO中过表达除与CCND1基因易位或倒置外，可能还有其他机制。诸多文献报道，claudin7在ChRCC中有较高的阳性率，如Lechpammer等[11]发现94%的ChRCC呈claudin7中等和强阳性，而RO仅55%阳性(P=0.041)；Osunkoya等[12]报道，7/11例ChRCC出现claudin7细胞膜表达和claudin8阴性的免疫组化模式，而17例RO仅1例出现此种表达模式(对ChRCC的敏感性为63%，特异性为84%，阳性预测值为88%)；claudin7阴性和claudin8细胞质阳性的免疫组化表达模式在10/17例RO中出现，而所有ChRCC(0/11)均无此种表达模式(对RO的敏感性为59%，特异性为100%，阳性预测值为100%)。国内杨敬等[13]报道claudin7在ChRCC和RO的阳性率分别为95.83%(23/24)和41.18%(7/17)。因此，Cyclin D1和claudin7联合检测以及后者的表达定位模式对于RO和ChRCC的鉴别具有重要意义。

Cyclin D1在其他不同组织类型的肾细胞癌中表达不一。Hedberg等[14]报道，53%(74/192)的CCRCC存在Cyclin D1高表达，其高表达与肿瘤具有较低的核分级、体积较小相关，并且阳性患者比阴性患者具有更长的生存期，但PRCC(10%，3/28)和ChRCC(21%，3/14)却很少表达。Calderaro等[15]报道所有的肾髓质癌均呈Cyclin D1阳性(6/6)。Leroy等[16]报道Cyclin D1在所有的CCTPRCC中均呈阳性，42例中有35例表现为弥漫强阳性(83%，35/42)，7例表现为灶状阳性。本组实验结果显示，Cyclin D1在70%的CCRCC(98/140)、57%的CCTPRCC(8/14)和43%的Xp11.2易位性肾细胞癌(6/14)中均有表达，但PRCC中却很少表达(3/34，均为灶状阳性)。统计结果显示，CCRCC与ChRCC、Xp11.2易位性肾细胞癌(P均<0.01)，PRCC与Xp11.2易位性肾细胞癌(χ2=4.28，P=0.039)，组间相比差异均有统计学意义；但Cyclin D1在CCRCC与CCTPRCC的表达相比，差异无统计学意义。

Choi等[17]应用免疫组化技术检测239例肾肿瘤中claudin7的表达，结果显示其在ChRCC、RO、PRCC和CCRCC中的阳性率分别为95%、72.7%、34.5%和3.4%，其对ChRCC诊断的敏感性和特异性分别为95.0%和92.3%。Hornsby等[18]发现，claudin7在67%(24/36)的ChRCC胞膜阳性，与CCRCC(0，0/42)、PRCC(28%，8/29)和RO(26%，10/43)相比差异有统计学意义(P<0.001)，提出claudin7膜染色可作为嫌色细胞癌和其他肾肿瘤，包括形态学相似的嗜酸细胞瘤鉴别的候选免疫指标之一。本组实验结果显示，claudin7除在ChRCC中有较高的阳性率外，在PRCC(50%，17/34)和CCTPRCC(57%，8/14)中也常有表达，而CCRCC(12/140，8.6%)和Xp11.2易位性肾细胞癌(2/14，14.3%)中却很少表达。统计分析显示，claudin7在CCRCC与ChRCC、CCTPRCC(χ2=110.3、26.57，P均<0.000 1)，PRCC与Xp11.2易位性肾细胞癌(χ2=5.29，P<0.05)，各组间相比差异均有统计学意义。联合检测Cyclin D1和claudin7发现，RO主要表现Cyclin D1阳性/claudin7阴性，相反，ChRCC为Cyclin D1阴性/claudin7阳性；CCRCC、CCTPRCCC、Xp11.2易位性肾癌分别表现为Cyclin D1阳性/claudin7阴性、Cyclin D1阳性/claudin7阳性和Cyclin D1阴性/claudin7阴性。

综上所述，Cyclin D1和claudin7在不同类型肾肿瘤中的表达，差异有显著性，联合应用对于某些形态学容易混淆的肾肿瘤组织学分型具有重要作用。

[1] Delahunt B, Egevad L, Montironi R,etal. International Society of Urological Pathology(ISUP)consensus conference on renal neoplasia: rationale and organization[J]. Am J Surg Pathol, 2013,37(10):1463-1468.

[2] Moch H, Humphrey P A, Ulbright T M,etal. WHO classification of tumours of the urinary system and male genital organs[M]. Lyon: IARC Press, 2016:18-44.

[3] Ravikumar G, Ananthamurthy A. Cyclin D1 expression in ductal carcinoma of the breast and its correlation with other prognostic parameters[J]. J Cancer Res, 2014,10(3):671-675.

[4] Sterlacci W, Fiegl M, Tzankov A. Prognostic and predictive value of cell cycle deregulation in non-small-cell lung cancer[J]. Pathobiology, 2012,79(4):175-194.

[5] 侯卫东, 胡学信, 刘艳峰. 甲状腺乳头状癌中Cyclin D1 表达和BRAF(V600E)突变的相关性及意义[J]. 临床与实验病理学杂志, 2014,30(12):1386-1390.

[6] Kim J K, Diehl J A. Nuclear cyclin D1: an oncogenic driver in human cancer[J]. J Cell Physiol, 2009,220(2):292-296.

[7] Mitic L L, Van Itallie C M, Anderson J M. Molecular physiology and pathophysiology of tight junctions I. Tight junction structure and function: lessons from mutant animals and proteins[J]. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, 2000,279(2):G250-G254.

[8] Sukov W R, Ketterling R P, Lager D J,etal. CCND1 rearrangements and cyclin D1 overexpression in renal oncocytomas: frequency, clinicopathologic features, and utility in differentiation from chromophobe renal cell carcinoma[J]. Hum Pathol, 2009,40(9):1296-1303.

[9] Jhang J S, Narayan G, Murty V V,etal. Renal oncocytomas with 11q13 rearrangements: cytogenetic, molecular, and immunohistochemical analysis of cyclin D1[J]. Cancer Genet Cytogenet, 2004,149(2):114-119.

[10] Zanssen S, Gunawan B, Fuzesi L,etal. Renal oncocytomas with rearrangements involving 11q13 contain breakpoints near CCND1[J]. Cancer Genet Cytogenet, 2004,149(2):120-124.

[11] Lechpammer M, Resnick M B, Sabo E,etal. The diagnostic and prognostic utility of claudin expression in renal cell neoplasms[J]. Mod Pathol, 2008,21(11):1320-1329.

[12] Osunkoya A O, Cohen C, Lawson D,etal. Claudin-7 and claudin-8: immunohistochemical markers for the differential diagnosis of chromophobe renal cell carcinoma and renal oncocytoma[J]. Hum Pathol, 2009,40(2):206-210.

[13] 杨 敬, 吴继峰. 嫌色性肾细胞癌和肾嗜酸细胞腺瘤中CK7、Claudin-7、Epcam、vimentin的表达及其临床意义[J]. 临床与实验病理学杂志, 2016,32(1):45-48.

[14] Hedberg L Ljungberg B, Roos G,etal. Expression of cyclin D1, D3, E, and p27 in human renal cell carcinoma analysed by tissue microarray[J]. Br J Cancer, 2003,88(9):1417-1423.

[15] Calderaro J, Moroch J, Pierron G,etal. SMARCB1/INI1 inactivation in renal medullary carcinomay[J]. Histopathology, 2012,61(3):428-435.

[16] Leroy X, Camparo P, Gnemmi V,etal. Clear cell papillary renal cell carcinoma is an indolent and low-grade neoplasm with overexpression of cyclin-D1[J]. Histopathology, 2014,64(7):1032-1036.

[17] Choi Y D, Kim K S, Ryu S,etal. Claudin-7 is highly expressed in chromophobe renal cell carcinoma and renal oncocytoma[J]. J Korean Med Sci, 2007,22(2):305-310.

[18] Hornsby C D, Cohen C, Amin M B,etal. Claudin-7 immunohistochemistry in renal tumors: a candidate marker for chromophobe renal cell carcinoma identified by gene expression profiling[J]. Arch Pathol Lab Med, 2007,131(10):1541-1546.