白蛋白导致肾小管上皮细胞NLRP3炎性体激活的机制分析

丁丽红，吕林莉，王德光，郝 丽

蛋白尿是许多肾小球疾病的共同临床表现，也是导致肾小管间质炎症和纤维化及慢性肾功能衰竭的一种重要致病因素[1]。已有研究表明蛋白尿可以直接或间接损伤肾小管上皮细胞，介导间质慢性炎症的发生。本组之前体内[2]和体外[3]的实验发现尿中白蛋白可以通过激活肾小管上皮细胞内的NLRP3炎性体，活化Caspase 1，释放IL-1β和IL-18引起肾小管间质炎症反应，但是白蛋白激活NLRP3炎性体的机制尚不明确。NLRP3炎性体是目前研究最为深入的炎性体，各种体内外的刺激因素可以通过细胞内钾离子外流、溶酶体膜破裂后组织蛋白酶B(Cathepsin B)释放和活性氧(ROS)产生这三种模式激活NLRP3炎性体[4]。本实验拟观察不同蛋白尿水平的膜性肾病患者肾组织中Cathepsin B的表达，并用高浓度的BSA体外刺激HK-2细胞，再分别用高浓度KCl、Cathepsin B的抑制剂CA 074 Me以及ROS的抑制剂二苯基氯化碘(diphenyliodonium chloride, DPI)作用于HK-2细胞，通过检测促炎因子IL-1β和IL-18生成的情况，探讨白蛋白激活NLRP3炎性体的可能途径和机制。

1 材料与方法

1.1临床资料选择30例经临床和肾穿刺活检确诊为原发性膜性肾病的患者，排除系统性红斑狼疮、乙肝相关性肾炎、肿瘤等继发性膜性肾病[5]。根据不同水平的24 h尿蛋白定量分为三组，其中低蛋白尿组(<1 g/24 h)、中蛋白尿组(1～3.5 g/24 h)和高蛋白尿组(>3.5 g/24 h)各10例。所选30例患者在肾穿刺活检前均未接受激素和(或)免疫抑制剂治疗。

1.2HK-2细胞的培养和干预于37 ℃ 5%CO2细胞培养箱中培养HK-2细胞，每3天更换新鲜含5%胎牛血清DMEM/F12培养液1次。干预前将HK-2细胞接种在6孔培养板，加入细胞培养液，培养至部分融合或全部融合时，用无血清DMEM/F12培养液洗2次后，去血清培养24 h，再给予20 mg/mL的BSA培养24 h。

1.3细胞药物干预HK-2细胞按0.5×106/mL种植于6孔板，细胞融合80%时加入不同的干预药，分别为：对照组、BSA干预组、高浓度KCl干预组、高浓度NaCl干预组、CA 074 Me干预组、DPI干预组和二甲基亚砜组(DMSO组)(溶剂对照)。加入KCl、NaCl和CA 074 Me时，同时加入BSA共同培养24 h，而DPI先单独干预HK-2细胞2 h后，再加入BSA共同刺激24 h。

1.4Westernblot将6孔板中细胞去除培养基，加入裂解液，离心取上清液检测蛋白浓度。取等量组织蛋白样本变性后凝胶电泳、转膜，5%脱脂奶粉TBST溶液室温封闭1 h，加入以封闭液稀释的Cathepsin B(1 ∶1 000，美国Santa Cruz公司)，IL-1β(1 ∶1 000，美国Santa Cruz公司)和IL-18(1 ∶1 000，美国Santa Cruz公司)一抗，4 ℃过夜，洗膜，加入TBST稀释的二抗 (1 ∶5 000)，室温孵育2 h，洗膜，ECL(美国GE Healthcare)化学发光法曝光。以β-actin(1 ∶1 000，美国Santa Cruz公司)作为内参照。

1.5实时荧光定量PCR6孔板细胞每孔加入Trizol试剂(美国Invitrogen公司)提取总RNA，取样品对总RNA进行纯度、浓度及完整性的测定。用反转录试剂盒(日本Takara公司)将总RNA反转录成cDNA。10 μL反应体系，条件为37 ℃ 15 min, 85 ℃ 5 s。实时荧光定量反应条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，40个循环。以双蒸水代替cDNA模板作为阴性对照。本实验所用引物由南京金斯瑞公司设计及合成，引物序列为：IL-1β上游5′-CCATGCAATTTGTGTCTTCC-3′，下游5′-ACAACAGGAAA GTCCAGGCT-3′，长度135 bp。IL-18上游5′-AGCTT GCTGAGCCCTTTG-3′，下游5′-TGTGTAGACTGCAG CAGGTG-3′，长度131 bp。GADPH上游5′-TGGT ATCGTGGAAGGACTCA-3′，下游5′-CCAGTAGAGGC AGGGATGAT-3′，长度132 bp。

1.6免疫组化法免疫组化采用SP法。将肾组织石蜡块连续3～4 μm厚切片，常规脱蜡至水，枸橼酸钠缓冲液(pH 6.0)微波修复后，采用免疫组化(SP试剂盒，福州迈新公司)检测Cathepsin B(1 ∶100，美国Santa Cruz公司)的表达。PBS缓冲液作为阴性对照。每张切片随机选取10个200倍视野，用Image-pro plus 6.0软件分析，以累计吸光度(A值)表示Cathepsin B阳性表达的相对含量。

2 结果

2.1CathepsinB在不同蛋白尿水平的膜性肾病患者肾组织中的表达免疫组化结果显示，Cathepsin B阳性信号表达于肾小管上皮细胞胞质，且低蛋白尿组膜性肾病患者肾小管上皮细胞中仅有少量表达，而高蛋白尿组肾小管上皮细胞中的表达显著增强，两组相比差异有统计学意义(P<0.05，图1)。

图1 不同蛋白尿水平的膜性肾病患者肾组织中Cathepsin B的表达

与低蛋白尿组相比，*P<0.05；与中蛋白尿组相比，#P<0.05

2.2BSA刺激HK-2细胞后CathepsinB蛋白的表达在体外实验中，用20 mg/mL浓度的BSA刺激HK-2细胞24 h后收集细胞，Western blot法检测HK-2细胞中Cathepsin B蛋白的表达，结果显示，BSA刺激后的HK-2细胞中，Cathepsin B蛋白明显高于对照组(图2)。

图2 Western blot法检测BSA刺激HK-2细胞后Cathepsin B蛋白的表达

Control: 对照组；AO: 白蛋白负荷组

2.3高浓度钾离子对BSA刺激的HK-2细胞中IL-1β和IL-18表达的影响为了验证钾离子外流是否为白蛋白激活NLRP3炎性体的途径，实验用20 mg/mL浓度的BSA刺激HK-2细胞，同时加入高浓度的KCl(150 mmol/L)、NaCl(150 mmol/L)共同刺激HK-2细胞，培养24 h后用Western blot和实时荧光定量PCR法检测IL-1β和IL-18的蛋白和mRNA表达变化，结果发现，与对照组相比，AO组、高浓度KCl组和NaCl组均可使IL-1β和IL-18的蛋白和mRNA水平显著升高(P<0.05)，但高浓度KCl组与AO组及高浓度NaCl组相比，高浓度KCl并未影响IL-1β和IL-18的蛋白和mRNA的表达水平，其差异无统计学意义(P>0.05，图3)。

图3 高浓度钾离子对BSA刺激的HK-2细胞中IL-1β、IL-18蛋白(A)和mRNA(B)表达的影响

与对照组相比，*P<0.05

2.4CathepsinB的抑制剂CA074Me对BSA刺激的HK-2细胞中IL-1β和IL-18表达的影响为了验证Cathepsin B释放是否为白蛋白激活NLRP3炎性体的途径，用20 mg/mL浓度的BSA体外刺激HK-2细胞时，同时加入CA 074 Me(10 μmol/L)和DMSO共同作用于HK-2细胞，培养24 h后收集细胞，Western blot和实时荧光定量PCR法检测IL-1β和IL-18的蛋白和mRNA表达的变化。结果发现，与对照组相比，AO组及DMSO组IL-1β和IL-18的蛋白和mRNA水平显著升高(P<0.05)；但与AO组相比，DMSO组IL-1β和IL-18的蛋白和mRNA水平无明显变化，而CA 074 Me组的Cathepsin B释放被抑制后，IL-1β和IL-18的蛋白和mRNA的水平明显降低，其差异有统计学意义(P<0.05，图4)。

图4 CA 074 Me对BSA刺激的HK-2细胞中IL-1β、IL-18蛋白(A)和mRNA(B)表达的影响

与对照组相比，*P<0.05；与AO组相比，#P<0.05

2.5ROS的抑制剂DPI对BSA刺激的HK-2细胞中IL-1β和IL-18表达的影响为了验证ROS生成增多是否为白蛋白激活NLRP3炎性体的途径，实验先用DPI(10 μmol/L)和DMSO作用于HK-2细胞2 h后，再加入20 mg/mL浓度的BSA刺激HK-2细胞，培养24 h后收集细胞，Western blot和实时荧光定量PCR法检测IL-1β、IL-18蛋白和mRNA表达的变化，结果发现，与对照组相比，AO组及DMSO组IL-1β、IL-18的蛋白和mRNA水平显著升高(P<0.05)，但与AO组相比，DMSO组IL-1β、IL-18的蛋白和mRNA水平无明显变化，而DPI组的ROS生成被抑制后，IL-1β、IL-18的蛋白和mRNA的水平明显降低，其差异有统计学意义(P<0.05，图5)。

与对照组相比，*P<0.05；与AO组相比，#P<0.05

3 讨论

研究表明，NLRP3炎性体可以被多种外源性病原相关分子模式(PAMPs)如细菌、病毒和真菌等，及内源性损伤相关分子模式(DAMPs)，如胞外ATP、UA等通过不同的途径激活，但其激活机制尚不清楚[6]。目前的研究大多数认为，细胞内钾离子外流、溶酶体膜破裂导致其内的Cathepsin B释放和ROS产生这三种模式[7]是NLRP3炎性体激活的主要方式，并且对这三种模式的研究较多。

钾离子外流相关活化通路：研究认为，上皮细胞和内皮细胞受损或者应激时ATP释放到胞外，胞外ATP或穿孔素可激活细胞膜上P2X7受体离子门控通道及pannexin-1通道开放，导致钙离子内流，钾离子外流，刺激物可以通过该微孔直接活化NLRP3炎性体[8]。另外，能通过介导该微孔结构活化的微生物毒素酶类(如尼日利亚菌素、气单胞菌溶素)均可由此激活NLRP3炎性体。还有研究表明，一些不能被细胞吞噬的晶体物质(如MSU)和某些毒素介导的微孔结构活化也能引起钾离子外流，最终导致NLRP3炎性体的活化。

Cathepsin B活化通路：细胞吞噬某些微粒样结构物质或晶体类后，如MSU[9]、二氧化硅、石棉等，可导致溶酶体损伤甚至破裂，溶酶体破裂后可释放Cathepsin B至胞质内，Cathepsin B通过某些方式激活NLRP3炎性体。研究表明，抑制溶酶体的破裂或减少Cathepsin B的释放可以阻断NLRP3炎性体的激活。其他类型的激活剂是否如晶体类或微粒样结构物质一样，通过影响溶酶体及Cathepsin B激活NLRP3炎性体，目前还不明确。

ROS介导的活化通路：根据文献报道可以发现，目前已知的多种NLRP3炎性体活化信号均能通过促进ROS生成而激活NLRP3炎性体，而且应用ROS清除剂或抑制剂后可以明显抑制NLRP3炎性体的活化。Zhou等[10]研究发现线粒体来源的ROS是引起NLRP3炎性体激活的关键信号，提示NLRP3炎性体激活与线粒体的功能密切相关。Tsehopp等[11]研究证实，使用ROS的抑制剂可以阻断NLRP3炎性体的激活，进而明显抑制IL-1β的生成，而且他认为在上述三种激活模式中，起最关键作用的是ROS的生产增多。本组前期实验也发现高浓度的白蛋白长期刺激可导致肾小管上皮细胞内线粒体的功能受损，引起ROS的生成增多，最终导致NLRP3炎性体的激活[12]。

在本组实验中，用高浓度KCl的目的是用较高的细胞外钾离子浓度抑制HK-2细胞的钾离子外流，为了排除高浓度导致的高渗状态对细胞可能产生的影响，用同样浓度的NaCl作为浓度对照，结果发现抑制钾离子外流后并没有引起BSA刺激的HK-2细胞中IL-1β和IL-18表达减少。用CA 074 Me的目的是抑制溶酶体破裂而释放的Cathepsin B，用DPI的目的是抑制ROS的产生，用DMSO作为溶剂对照，结果发现CA 074 Me以及DPI分别抑制Cathepsin B的释放和ROS的生成后，均可引起IL-1β和IL-18的表达明显减少，这表明白蛋白引起的肾小管上皮细胞NLRP3炎性体的激活可能与钾离子外流无关，而与Cathepsin B的释放和ROS的生成有关。

众所周知，尿中的蛋白成分经过肾小球过滤进入肾小管后，可以被肾小管重吸收，已有研究表明，绝大部分肾小管腔内的蛋白是与近端肾小管上皮细胞刷状缘上的Cubilin和Megalin受体蛋白结合后，再被转运至溶酶体内进行分解、利用[13]，所以健康人每日尿中蛋白质的含量小于150 mg。但当进入近端肾小管内的蛋白量超出其重吸收能力时，尿中就会出现较多的蛋白，从而形成蛋白尿。因此，我们推测当大量尿蛋白进入小管腔时，肾小管重吸收蛋白系统的负荷也会明显增加，一方面重吸收的蛋白使上皮细胞的溶酶体活性增加，导致溶酶体破裂后，其内的Cathepsin B释放入胞质内，从而激活NLRP3炎性体；另一方面小管上皮细胞对蛋白的重吸收和处理需要消耗的能量也增加，除了导致小管细胞缺氧损伤外，生成的ROS也增多，最终激活NLRP3炎性体。此外，大量的蛋白尿滞留在小管腔内还可以形成蛋白管型，堵塞管腔，使小管上皮细胞缺氧加重，最终导致小管萎缩及纤维化。上述这些因素可能是大量白蛋白长期作用，导致肾小管上皮细胞内NLRP3炎性体激活，并造成小管间质炎症及纤维化的机制。

综上所述，白蛋白可能是通过肾小管上皮细胞中Cathepsin B释放和ROS生成增多这两条途径激活NLRP3炎性体，这为研究蛋白尿导致肾小管间质炎症和纤维化的机制提供新的理论和实验依据，也为延缓慢性肾脏病发生、发展及治疗提供新方向。

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