0#柴油和流花原油对斑节对虾(Penaeus monodon)幼体的急性毒性效应

张喆，陈海刚，温为庚,3，张林宝，黄南建,2，胡莹，贾晓平，蔡文贵,

1. 中国水产科学研究院南海水产研究所，广东省渔业生态环境重点实验室，农业部南海渔业资源开发利用重点实验室，广州 510300 2. 上海海洋大学海洋科学学院，上海 201306 3. 中国水产科学研究院南海水产研究所，海南热带水产研究开发中心，三亚 572018

近年来，随着我国经济的高速发展，对石油产品的需求量呈逐年上升的趋势。2014年，我国进口原油达到3.1亿吨，基本均是通过船舶运输进入我国。石油类污染物成为我国近海海洋环境的主要污染物之一，给海洋生态系统造成严重的影响。据2015年中国海洋环境状况公报数据显示，仅2015年就有近5.9万吨石油类物质随河流排入海洋[1]，与此同时，船舶运输造成的泄漏和海浪海潮运动导致的溢油迁移均会影响海洋生态系统的平衡[2]。国内外诸多研究表明，原油和燃料油可影响海洋藻类[3]、浮游生物[4]、贝类[5]和鱼类[6]的生长发育，进而导致海洋生物的多样性和海洋生态系统的结构发生改变。因此，研究溢油污染对海洋生物的毒性效应，对评价溢油污染的毒性，保护海洋生态系统的健康具有重要意义。

我国学者相继开展了燃料油和原油对不同种类对虾的毒性试验。唐峰华等[7]分析了8种油品对中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)和日本囊对虾(Marsupenaeus japonicus)的急性毒性，获得不同油品对上述对虾的急性毒性数据。沈新强等[8]的研究表明，平湖原油对脊尾白虾(Palaemon carincauda)的毒性存在显著的剂量-效应关系，上述研究对深入探讨不同种类油品对海洋虾类的毒性效应具有重要意义。然而，目前有关南海原油对斑节对虾(Penaeus monodon)，尤其是其不同发育阶段幼体毒性效应的研究尚未见报道。斑节对虾广泛分布于西太平洋和印度洋沿岸区域，在我国浙江、福建、广东、海南和广西沿岸均有分布，是世界三大养殖虾类品种之一，广东斑节对虾产量占到全国总产量的55%[9]。本文以斑节对虾为研究对象，分析0#柴油和LH原油分散剂乳化液对斑节对虾不同发育阶段幼体的急性毒性，旨在为评价石油类污染对海洋生物毒性效应提供基础数据，为评估溢油和石油类污染对海洋生态系统的影响提供科学依据。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物

斑节对虾无节幼体(N1/N2，体长(0.32±0.01) mm)、蚤状幼体(Z1，体长(1.05±0.01) mm)、糠虾(M1，体长(3.81±0.08) mm)和仔虾(P2，体长(0.92±0.11) mm)取自南海水产研究所海南热带水产研究开发中心，实验时选用规格、发育阶段一致的健康幼体作为实验对象。实验用海水取自南海水产研究所海南热带水产研究开发中心，为经活性碳过滤净化和消毒的自然海水，水温(29.2 ± 0.8) ℃，盐度30‰ ± 1‰，pH值7.2 ± 0.1，溶解氧饱和度不低于87.64%，每12 h更换海水1次，并及时吸出死亡个体。

1.1.2 实验试剂

实验用0#柴油购自深圳市大鹏镇中石化南澳加油站，原油取自中国南海流花油田，溢油分散剂购自广州富肯环保科技有限公司(富肯-3号溢油分散剂)，其他实验用分析试剂均为分析纯，购自广东国药集团。

1.2 实验方法

1.2.1 0#柴油和南海LH原油分散剂乳化液母液制备

将溢油分散剂分别与LH原油、0#柴油按1:1(V:V)混合于50 mL小烧杯中，置于超声波洗涤器中超声5 min，后将该超声后的混合液以1:10(V:V)的比例加入过滤海水中，于超声波洗涤器中连续超声3 h后分液漏斗静置3 h，取下层水相液保存于棕色瓶中，即为0#柴油和LH原油乳化液母液。制备后的0#柴油和LH原油乳化液母液参照文献方法[10]进行总石油烃(total petroleum hydrocarbon, THP)含量的测定。

1.2.2 急性毒性实验

斑节对虾由受精卵发育到仔虾共经历无节幼体、蚤状幼体、糠虾和仔虾等几个阶段，其中无节幼体变态到蚤状幼体大约需要35 h左右，蚤状幼体变态到糠虾大概需要96 h，糠虾发育到仔虾大约96～120 h[11]。本实验考虑到斑节对虾不同发育阶段对饵料、氧气的需求以及实验体系的需要，将无节幼体和蚤状幼体实验时间设置为48 h，糠虾和仔虾设置为96 h。

以预实验结果为依据，采用以10为底的等对数间距设置不同石油烃浓度的0#柴油和LH原油乳化液作用于斑节对虾不同发育阶段幼体(表1)，同时设置空白对照组(control group, CG)和分散剂对照组(dispersant control group, DCG)。其中，分散剂对照组中分散剂浓度与实验组最高浓度组所添加的分散剂浓度一致，并通过向低浓度实验组补充分散剂的形式保证各实验组分散剂浓度一致。配制实验液前用UV-2550紫外可见分光光度计(岛津仪器有限公司)测定母液总石油烃浓度。

无节幼体和蚤状幼体根据预实验结果分别设置10个浓度组、1个空白对照组和1个分散剂对照组，实验连续进行48 h。正式实验于100 mL烧杯中进行，每个烧杯加入50 mL海水，每个浓度组3个平行，每个平行大约200～300个个体。分别于24 h和48 h使用胶头滴管随机取样于实体解剖镜下进行观察计数，无节幼体和蚤状幼体以在解剖镜下针尖碰触后无反应作为死亡标准，分别于实验36 h和48 h记录无节幼体变态率。正式实验期间每12 h更换全部试液1次，溶解氧饱和度为92.37% ± 2.59%，胁迫期间不投喂。

表1 0#柴油和南海LH原油乳化液实验浓度Table 1 Experimental solutions of No. 0 diesel and LH crude oil

注：同一实验组0#柴油与南海LH原油浓度梯度设置相同。

Note: Same TPH concentrations of No. 0 diesel and LH crude oil were set according to same experimental groups.

糠虾和仔虾则分别设置5个浓度组、1个空白对照组和1个分散剂对照组，实验连续进行96 h。正式实验于2 L烧杯中进行，每个浓度组3个平行，每个烧杯加入1.2 L砂滤海水和40～50个对虾个体，每12 h换水1次，分别于24 h、48 h、72 h和96 h记录对虾死亡情况。糠虾和仔虾以躯干弯曲、僵硬、玻璃棒碰触无反应为死亡标准，整个实验期间不投喂，溶解氧饱和度为95.57% ± 1.25%。

1.2.3 统计与分析

实验结果均采用平均数±标准差(mean ± SD)表示，所得数据采用SPSS 13.0统计软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，用Duncan’s法对均值进行多重比较，显著水平为P < 0.05。实验中用存活率和变态率来反映0#柴油和LH原油乳化液对斑节对虾生长和变态发育的影响，存活率(%)= 实验期间存活个体数/实验个体总数×100%，变态率(%)= 变态个体数/存活个体总数×100%[12]。采用直线内插法分别计算48 h和96 h 0#柴油和LH原油对斑节对虾不同发育阶段幼体的半致死浓度，计算斑节对虾幼体存活安全浓度。其中，针对无节幼体和蚤状幼体，安全浓度=48 h-LC50× 0.1[13]；针对糠虾和仔虾，安全浓度=96 h-LC50× 0.1[14]。

2 结果与分析(Results and analysis)

2.1 斑节对虾不同发育阶段幼体中毒症状

前期实验表明，本实验所用富肯-3号溢油分散剂在实验浓度范围内对实验生物并无显著的影响，表明其对试验生物的毒性较小，适于作为助溶剂进行实验[15]。

空白对照组和分散剂对照组无节幼体和蚤状幼体刚毛、附肢、尾棘直，粗壮，游泳迅速，趋光性强；暴露于0#柴油和LH原油乳化液后，无节幼体附肢和刚毛弯曲可折断，蚤状幼体躯干严重弯曲，两者游泳能力和趋光性均较弱，导致多个个体聚集成群。无节幼体和蚤状幼体死亡时躯体变为白色，聚集沉于水底。糠虾和仔虾暴露于0#柴油和LH原油初期，低浓度组与对照组没有显著的行为差异，而高浓度组则表现出一定的兴奋效应，在烧杯内快速游动。随着暴露时间的延长和暴露浓度的增加，其活力逐渐下降，匍匐于烧杯底部，活动较少，对外界刺激反应迟钝直至死亡。死亡糠虾和仔虾侧躺弯曲，死亡糠虾通体呈现白色，而仔虾则通体为暗红色。

2.2 0#柴油和LH原油对斑节对虾不同发育阶段幼体的剂量-效应关系

图1所示为0#柴油和LH原油乳化液对斑节对虾无节幼体死亡率和变态率的影响。由图中可知，分散剂对照组无节幼体死亡率和变态率与空白对照组没有显著性差异(P > 0.05)，而0#柴油和LH原油乳化液均对斑节对虾无节幼体具有较大毒性，0.1 mg·L-1暴露24 h即可导致无节幼体的死亡，而高浓度暴露24 h后实验生物死亡率可达到96%左右。0#柴油乳化液可以影响斑节对虾无节幼体变态率(图1)。3.59 mg·L-10#柴油作用36 h后，无节幼体变态率下降为93.67%，与对照组存在显著差异(P < 0.05)；当暴露浓度为10.0 mg·L-1时，无节幼体变态率下降到最低，为76.33%；暴露浓度低于2.15 mg·L-1时，实验组与对照组无节幼体变态率差异不显著(P > 0.05)。0#柴油胁迫48 h后，3.59 mg·L-1、5.99 mg·L-1和10.00 mg·L-1浓度组无节幼体变态率分别为93.98%、90.85%和86.88%，仍然显著低于对照组(P < 0.05)。

图1 0#柴油(a)和LH原油(b)乳化液对斑节对虾无节幼体浓度-剂量效应注：*代表无节幼体36 h和48 h变态率与空白组存在显著差异(P < 0.05)；CG和DCG分别代表空白对照组和分散剂对照组，其总石油烃浓度均为0.00 mg·L-1。Fig. 1 Dose-response of No. 0 diesel emulsion (a) and LH crude oil emulsion (b) to naupliusNote: * represents significant difference of nauplius’ metamorphosis rate between control and experimental groups after 36 and 48 hours (P < 0.05); CG and DCG represent control and dispersant control groups respectively, in which the concentration of THP are both 0.00 mg·L-1.

LH原油同样可以影响无节幼体变态率，低浓度时无节幼体变态率差异不显著，而随着暴露浓度的增加变态率逐渐下降，胁迫36 h后当浓度仅为0.77 mg·L-1时，变态率即与空白对照组存在显著差异(P < 0.05)。3.59 mg·L-1、5.99 mg·L-1和10.0 mg·L-1浓度组无节幼体变态率分别为90.45%、83.33%和69.68%，均显著低于对照组(P < 0.05)。胁迫48 h后，高浓度组无节幼体变态率略有升高，3.59 mg·L-1、5.99 mg·L-1和10.0 mg·L-1浓度组无节幼体变态率分别为92.95%、90.78%和83.52%。

0#柴油和LH原油乳化液对斑节对虾蚤状幼体剂量-效应关系见图2。0.10 mg·L-10#柴油和LH原油暴露24 h后，斑节对虾蚤状幼体即开始出现死亡，0.77 mg·L-10#柴油乳化液暴露24 h后蚤状幼体死亡率达到51.67%，48 h后死亡率达到63.3%；10

mg·L-10#柴油乳化液作用24 h，蚤状幼体即全部死亡。LH原油乳化液毒性较之0#柴油乳化液略小。当LH原油暴露浓度为0.77 mg·L-1时，蚤状幼体24 h和48 h死亡率分别为46.67%和58.30%。随着暴露浓度的增加，蚤状幼体死亡率逐渐上升，10 mg·L-1浓度组在24 h和48 h死亡率分别达到96.67%和100%。当石油烃含量高于0.17 mg·L-1时，各个时间点蚤状幼体死亡率均显著高于空白组(P < 0.05)。

图2 0#柴油和LH原油乳化液对斑节对虾蚤状幼体浓度-剂量效应注： *代表该浓度组各时间点蚤状幼体死亡率均与空白组存在显著差异(P < 0.05)；CG和DCG分别代表空白对照组和分散剂对照组，其总石油烃浓度均为0.00 mg·L-1。Fig. 2 Dose-response of No. 0 diesel emulsion (a) and LH crude oil emulsion (b) to protozoeaNote: *represents significant difference of protozoea mortality between control and experimental groups at different times (P < 0.05); CG and DCG represent control and dispersant control groups respectively, in which the concentration of THP are both 0.00 mg·L-1.

图3 0#柴油(a)和LH原油(b)对斑节对虾糠虾的浓度-剂量效应注：*代表该浓度组各时间点糠虾死亡率均与空白组存在显著差异(P < 0.05)；CG和DCG分别代表空白对照组和分散剂对照组，其总石油烃浓度均为0.00 mg·L-1。Fig. 3 Dose-response of No. 0 diesel emulsion (a) and LH crude oil emulsion (b) to mysisNote: *represents significant difference of mysis mortality between control and experimental groups at different times (P < 0.05); CG and DCG represent control and dispersant control groups respectively, in which the concentration of THP are both 0.00 mg·L-1.

图3和图4所示分别为0#柴油和LH原油乳化液对斑节对虾糠虾和仔虾的剂量-效应关系。0.5 mg·L-10#柴油和LH原油乳化液作用24 h后，斑节对虾糠虾均未出现死亡，48 h后死亡率则分别为10%和8.33%。1.58 mg·L-10#柴油乳化液作用后的72 h和96 h，糠虾死亡率分别达到55.00%和66.67%，而相同浓度LH原油组的死亡率则分别为48.33%和60.00%。当斑节对虾糠虾暴露于最高浓度(5 mg·L-1)96 h后，0#柴油和LH原油实验组的死亡率均达到95.00%，且当石油烃含量高于0.89 mg·L-1时，各个时间点糠虾死亡率均显著高于空白组(P < 0.05)。较之糠虾，仔虾对0#柴油和LH原油的耐受力较高。当暴露浓度为3.16 mg·L-1和7.95 mg·L-1时，0#柴油组仔虾96 h死亡率分别为81.67%和96.67%，而LH原油组则分别为71.67%和91.67%。当浓度升高到20 mg·L-1时，0#柴油和LH原油暴露72 h后仔虾的死亡率分别为98.33%和93.33%，2个实验组96 h的死亡率则均达到100%。当石油烃含量高于1.26 mg·L-1时，各个时间点仔虾死亡率均显著高于空白组(P < 0.05)。

2.3 0#柴油和LH原油对斑节对虾不同发育阶段幼体的半致死浓度和安全浓度

如表2所示，0#柴油对斑节对虾无节幼体和蚤状幼体的48 h-LC50分别为0.55 mg·L-1(0.45～0.65 mg·L-1)和0.42 mg·L-1(0.34～0.50 mg·L-1)，LH原油对斑节对虾无节幼体和蚤状幼体的48 h-LC50分别为0.62 mg·L-1(0.51～0.75 mg·L-1)和0.51 mg·L-1(0.42～0.61 mg·L-1)，蚤状幼体对0#柴油和LH原油乳化液的耐受能力大于无节幼体。0#柴油和LH原油对糠虾的96 h-LC50分别为0.95 mg·L-1(0.78～1.13 mg·L-1)和1.05 mg·L-1(0.86～1.25 mg·L-1)，对仔虾的96 h-LC50分别为1.09 mg·L-1(0.85～1.35 mg·L-1)和1.42 mg·L-1(1.11～1.71 mg·L-1)，糠虾和仔虾对0#柴油和LH原油的耐受能力顺序均为仔虾 > 糠虾，2种油对斑节对虾不同发育阶段幼体的毒性大小顺序均为0#柴油乳化液 > LH原油乳化液。0#柴油对斑节对虾无节幼体、蚤状幼体、糠虾和仔虾的安全浓度分别为0.05 mg·L-1、0.04 mg·L-1、0.10 mg·L-1和0.11mg·L-1，LH原油对无节幼体、蚤状幼体、糠虾和仔虾的安全浓度分别为0.06 mg·L-1、0.05 mg·L-1、0.11 mg·L-1和0.14mg·L-1。

图4 0#柴油(a)和LH原油(b)对斑节对虾仔虾的剂量-效应注：*代表该浓度组各时间点仔虾死亡率均与空白组存在显著差异(P < 0.05)；CG和DCG分别代表空白对照组和分散剂对照组，其总石油烃浓度均为0.00 mg·L-1。Fig. 4 Dose-response of No. 0 diesel emulsion (a) and LH crude oil emulsion (b) to post-larvaeNote: *represents significant difference of post-larvae mortality between control and experimental groups at different times (P < 0.05); CG and DCG represent control and dispersant control groups respectively, in which the concentration of THP are both 0.00 mg·L-1.

3 讨论(Discussion)

3.1 0#柴油和LH原油对斑节对虾无节幼体变态率的影响

溢油污染可以对多种生物的早期生长发育造成影响[6, 16]。吴彰宽和陈民山[17]分析胜利油田对对虾无节幼体变态率的影响时发现，其对无节幼体影响的最低浓度为3.2 mg·L-1，油浓度为10 mg·L-1时，幼体变态率开始迅速下降，当浓度达到100 mg·L-1时，无节幼体变态率仅为35%左右。杨柏林等[18]和吕福荣等[19]在分析石油烃对海胆胚胎的发育毒性时也发现，0#柴油分散液对海胆胚胎发育各个时期具有不同程度的延迟效应，120#燃料油可以显著延长海胆胚胎发育的时间，分散剂的加入使得该延迟效应更加明显[20]。本研究结果表明0#柴油和LH原油可以影响斑节对虾无节幼体的变态率，3.59 mg·L-10#柴油和0.77 mg·L-1原油即可影响斑节对虾无节幼体的发育。由36 h和48 h无节幼体变态率可知，LH原油对斑节对虾无节幼体发育的影响要大于0#柴油，这可能是在原油蒸馏为柴油的过程中，失去的部分化合物可能会对对虾发育产生较大影响。随着暴露浓度的升高，斑节对虾无节幼体变态率逐渐下降，而暴露48 h后，高浓度组变态率略有升高，说明与之前的研究结果相似，一定浓度0#柴油和LH原油乳化液显著延长了无节幼体发育到蚤状幼体的时间。鉴于试验设置时间较短，在试验期内仅观察到无节幼体的变态发育，有关0#柴油和LH原油对斑节对虾其他发育阶段幼体变态率的影响仍需要进一步的研究。

3.2 斑节对虾不同发育阶段幼体对0#柴油和LH原油的耐受性差异

我国学者围绕溢油污染对海洋生物幼体的急性毒性积累了大量数据，这些结果因油品、试验生物个体大小及种间差异而不同。唐峰华等[7]研究发现，不同油品分散液对中国明对虾和日本囊对虾的LC50分别为0.60～754.87 mg·L-1和0.002～7.62 mg·L-1，可见不同油品之间以及不同的试验物种之间差别较大。Hemmer等[21]的研究结果显示LSC原油乳化液对糠虾(Americamysis bahia)的LC50介于0.39～9.7 mg·L-1之间，其对糠虾的毒性因使用的分散剂不同而存在差异。另有研究表明，原油和0#柴油乳化液对3月龄幼参的96 h-LC50分别为246.09 mg·L-1和125.89 mg·L-1[14]；0#柴油分散液对马粪海胆浮游幼虫48 h和72 h的EC50分别为3.39 mg·L-1和1.87 mg·L-1[22]；溢油分散剂处理的平湖原油对脊尾白虾幼体的96 h-LC50为1.20 mg·L-1[8]；原油乳化液对凡纳滨对虾(Litopenaeus Vannamei)成体的48 h-LC50则为631.46 mg·L-1[23]。综合以上的结果可以发现，溢油污染对海洋无脊椎动物幼体的LC50大多介于0.39～246.09 mg·L-1之间，远低于其对海洋无脊椎动物成体的LC50。本研究结果表明，0#柴油和LH原油对斑节对虾不同发育阶段幼体的LC50分别介于0.42～1.09 mg·L-1和0.51～1.42 mg·L-1之间。根据鱼类毒性等级分级标准[24]，0#柴油和LH原油乳化液对斑节对虾不同发育阶段幼体毒性均为剧毒(LC50< 1 mg·L-1)。与以往的研究结果相比，本次获得的LC50数值较低可能存在以下原因：第一，本文采用斑节对虾早期发育阶段幼体，其对溢油污染的耐受力较之成体要差；第二，本研究结果为0#柴油和原油乳化液结果，分散剂的加入可能使柴油和原油的毒性增加；第三，本次试验水温较高，平均水温在29 ℃左右，水温较高时实验生物的耐受性会有所下降[25]。

表2 0#柴油和南海LH原油乳化液对斑节对虾不同发育阶段幼体的48 h/96 h-LC50Table 2 48 h/96 h-LC50 and 95% confidence interval of No. 0 diesel oil and LH crude oil emulsion to different development stages of P. monodon

注：*无节幼体和蚤状幼体为48 h-LC50，糠虾和仔虾为96 h-LC50。

Note: 48 h-LC50of nauplius and protozoea were calculated, and 96 h-LC50of mysis and post-larvae were calculated.

生物不同发育阶段幼体对污染物的敏感度存在显著差异。黄逸君等[4]分析了原油乳化液对10种海洋桡足类的急性毒性，其对海洋桡足类的急性毒性介于82.33～856.64 mg·L-1之间，且毒性随着物种个体的增大而减弱。然而对虾对污染物的耐受力却并不一定随着其个体的增长而增加。吴彰宽和陈民山[17]研究发现对虾不同发育阶段幼体对石油的耐受能力依次为受精卵 > 仔虾 > 无节幼体 > 糠虾 > 蚤状幼体，认为在评价石油污染对对虾的影响时，应首先考虑其对蚤状幼体的影响。温为庚等[26]分析了复方三氯异氰尿酸对斑节对虾幼体的毒性，发现其对试验药物的耐受力依次为仔虾 > 无节幼体 > 糠虾 > 蚤状幼体。本研究也发现了上述现象，斑节对虾不同发育阶段幼体对0#柴油和原油的耐受能力依次为仔虾 > 糠虾 > 无节幼体 > 蚤状幼体。虽然无节幼体个体较蚤状幼体小、发育阶段较早，但其对0#柴油和LH原油的耐受能力较蚤状幼体强，可能是因为无节幼体主要依靠卵黄营养生长尚未摄食，而蚤状幼体处于变态阶段，对外源污染物更为敏感[27]。

3.3 0#柴油和LH原油对斑节对虾幼体的毒性差异

不同油品之间存在毒性差异，LH原油对斑节对虾不同发育阶段幼体的毒性均小于0#柴油，这一结果在以往的研究中被屡次证实。唐峰华等[28]研究了4种原油和4种成品油对中国明对虾和日本囊对虾仔虾的急性毒性效应，发现成品油F180和F120对仔虾的毒性最大，原油TJ016对仔虾的毒性最小。原油由饱和烃、芳香烃、沥青质和树脂等有机物组成，这些有机物中大约有75%的烃类物质[29]，而在0#柴油分散液中，苯、萘、菲等芳烃及其取代物占22.1%，烷烃占50%左右。不论是原油还是0#柴油，芳香烃均被认为是其毒性最大的成分[2,30]，其毒性往往大于烷烃类化合物[22]。研究显示，相比总石油烃含量而言，2～4环的多环芳烃(polycyclic aromatic hydrocarbon, PAH)含量更能准确反映原油对生物体的毒性[31]。Anderson等[32]的研究表明，Corexit 9500A分散剂的使用，显著增加了原油对Rhithropanopeus harrisii幼体的毒性，认为是由于分散剂的加入，使得乳化液中PAH的浓度增加，显著增加了原油乳化液的毒性。Cohen等[33]发现，MC-252原油水溶液和乳化液对夏唇角水蚤的48 h-LC50分别为61 μg·L-1和255 μg·L-1，而此时二者的总PAH含量非常接近，分别为70.8 μg·L-1和74.3 μg·L-1，分散剂的加入，使得PAH形成了不利于被桡足类摄食的较大的液滴，因此从总石油烃含量来看，分散剂的加入降低了原油的毒性。鉴于此，在今后的研究中，除测定总石油烃含量外，建议应增加PAH相关含量的检测，以使得研究结果更加准确。

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