基于高通量测序的工业园区地下水和土壤细菌群落结构比较研究

薛银刚，刘菲，周璐璐，金珊，姜逸，王颖聪，江晓栋，王倩，施昕澜，薛柯

1. 常州大学环境与安全工程学院，常州 213164 2. 常州市环境监测中心，江苏省环境保护水环境生物监测重点实验室，常州 213001 3. 南京市浦口区水利工程管理服务站，南京 211800

微生物参与地下水和土壤中碳氮循环、有机物分解和能量传输过程，其群落组成和多样性可以反映地下水和土壤生态系统的功能和结构[1-2]。地下水细菌群落特性与水生生态环境具有高度相关性，群落结构的改变往往比水文地球化学指标的变化更为敏感，其结构特征、功能状态和多样性变化可以用于反映水体生态系统对污染输入胁迫的恢复力[3]。细菌是土壤微生物中数量最多的类别，能够促进土壤中有机质的分解和营养物质的释放，对维持土壤生态系统能量流动和物质循环具有重要作用[4-5]。通过细菌群落结构与组成反映周围环境所带来的影响和自身生态现状是考察地下水和土壤生态平衡的重要方法之一[6]。

工业园区在我国已成为工业企业集中发展的平台，已有研究学者对工业园区的环境样品进行取样调查。陈玲等[7]对上海化学工业区土壤环境进行研究，了解了该地区土壤中各种重金属元素的环境背景值。Liu等[8]对我国东部化学工业园区半挥发性有机污染物污染(semi volatile organic compounds，SVOCs)进行调查，结果表明，SVOCs在地表水、地下水和土壤中的检出率分别为15.93%、12.39%和20.35%。而地下水和土壤中的细菌群落是对污染输入的直接反映者，目前关于工业园区地下水和土壤细菌群落的研究还较少。近年来，研究微生物多样性的方法已经不限于传统的实验室纯培养，被称为“下一代”测序技术的高通量测序技术能一次快速地对数以百万的DNA分子进行序列测定，被认定为研究微生物群落特征和功能特性的高效手段[9-11]。

本次研究选取江苏省常州市某工业园区作为研究对象，为了获得地下水和土壤细菌群落结构特征、功能及多样性，根据所扩增的16S区域特点，基于Illumina HiSeq测序平台，利用双末端测序的方法，构建小片段文库进行双末端测序。通过对工业园区地下水和土壤细菌群落进行细致全貌的分析，用细菌群落丰度、多样性和丰富度指数研究地下水和土壤细菌群落结构特征和差异，以反映研究区域生态环境现状，为工业园区地下水和土壤生态环境评价提供方法支撑。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 样点位置和样品采集

采样区位于常州市某工业园区(119°39′43″，31°43′31″)，园区内已有地下水监测井且保存完好，减少了不必要的钻探工作量。采样时间为2016年12月，共选取3口浅层地下水监测井GW1(119°37′11″，31°43′32″)、GW2(119°37′46″，31°44′47″)和GW3(119°34′60″，31°45′45″)，并在地下水监测井旁采集土壤样品(S1、S2和S3)。

地下水采样前需洗井，抽出井管中的滞水，使含水层中新鲜水充入井管，根据每口井的水深度和地下水回水速度，确定具体的抽水时间。洗井完成后，待地下水水位达到平衡，使用贝勒管(Safelab-123，北京赛福莱博科技有限公司)于地面下3 m采集地下水。在各个监测井旁用螺旋钻取土，采集深度为3 m处的土壤。样品采集后，利用冷藏保存箱运输至实验室。使用经0.45 μm的混合纤维素滤膜过滤的地下水水样用于测定水体理化指标；用于DNA提取的水样先经5 μm孔径滤膜过滤除去颗粒杂质，再通过0.22 μm孔径滤膜过滤；每个土壤样品分为2份，过0.2 mm筛，分别用于理化指标的测定和DNA的提取；用于DNA提取的样品放置于-20 ℃保存备用。

1.2 理化指标测定

地下水理化指标的分析采用常规的理化监测方法：pH值(玻璃电极法，GB/T 6920—1986)；总硬度(EDTA法，GB/T 5750.04—2006)；氟化物(离子选择电极法，GB/T 7484—1987)；硝酸盐氮(紫外分光光度法，HJ/T 346—2007)；氨氮(纳氏试剂分光光度法，HJ 536—2009)；锰(火焰原子吸收分光光度法，GB/T 11911—1989)；镉、铜、锌(电感耦合等离子体质谱法，HJ 700—2014)。

土壤理化指标的分析采用常规的理化监测方法：pH值(玻璃电极法，GB/T 6920—1986)；含水率(70 ℃烘箱干燥，LY/T 1213—1999)；氟化物(离子选择电极法，GB/T 7484—1987)；总磷(钼锑抗分光光度法，HJ 632—2011)；全氮(半微量凯氏法，LY/T 1228—1999)；铬、铜、镍、锌(电感耦合等离子体质谱法，HJ 700—2014)。

1.3 DNA提取

使用FastDNA Spin Kit for Soil试剂盒(MP bio，USA)提取样品基因组DNA，具体步骤按照试剂盒说明书。为了减少实验误差，每个采样点的样品做3次平行，提取的样品DNA使用NanoDrop2000超微量蛋白质核酸分析仪(Thermo Fisher，USA)测定提取出的DNA浓度和纯度后，经提取成功后混匀为1个样品置于-20 °C中保存，用于后续的PCR扩增等分析。

1.4 PCR扩增

将提取好的DNA产物使用16S rDNA V4区引物(515F和806R)进行PCR扩增。PCR扩增体系为50 μL，为Ex Taq DNA 0.25 μL，10 × Ex Taq Buffer 5 μL，25 mmol MgCl24 μL，dNTP 4 μL，正向和反向引物各1 μL，DNA模板2 μL，超纯水32.75 μL。PCR扩增过程：98 ℃预变性5 min后，98 ℃变性30 s，退火温度50 ℃下反应30 s，72 ℃延伸40 s，共计20个循环，最后于72 ℃下延伸10 min。扩增产物用1%的琼脂糖电泳进行检测，并以等密度比混合后使用Qiagen Gel Extraction Kit (Qiagen，Germany)纯化。

1.5 高通量测序

纯化后的产物送至诺禾致源测序公司，使用Illumina (USA)的Hiseq平台进行高通量测序和分析。使用TruSeq®DNA PCR-Free样品制备试剂盒(Illumina，USA)生成测序文库。使用Qubit @ 2.0荧光计(Thermo Scientific)和Agilent Bioanalyzer 2100系统(Agilent，USA)评估测序文库质量。最后，在Illumina HiSeq 2500平台(Illumina，USA)上进行了测序。

1.6 生物信息统计分析

根据Barcode序列和PCR扩增引物序列从下机数据中拆分出各样品数据，截去Barcode和引物序列后使用FLASH(版本1.2.7)[12]对每个样品的reads进行拼接，参照Qiime(版本1.7.0)[13]的Tags质量控制流程，进行Tags截取和长度过滤后去除嵌合体序列，得到最终的有效数据(Effective Tags)。

利用Uparse软件(版本7.0.1001)[14]对所有样品的全部Effective Tags进行聚类，以97%的一致性(Identity)将序列聚类成为操作分类单元(operational taxonomic units，OTUs)，同时会选取OTUs的代表性序列，用Mothur方法与SILVA的SSUrRNA数据库[15]进行物种注释分析(设定阈值为0.8～1)，获得分类学信息并分别在各个分类水平统计各样本的群落组成。香浓指数(Shannon index)、辛普森指数(Simpson index)、Chao1指数(Chao1 index)和ACE指数(ACE index)通过QIIME软件(版本1.7.0)计算。

2 结果(Results)

2.1 理化指标

不同点位地下水和土壤的理化性质见表1和表2，该工业园区地下水呈弱酸性，土壤呈弱碱性。根据《地下水质量标准》(GB14848—93)III类标准限值为基准，除锰外，地下水各项指标均未超标。土壤氟化物以S1采样点含量最高，土壤总磷和全氮以S2采样点含量最高，砷、铜、镍、锌在该化工园区不同点位也均有检出，含量未超过国家《土壤环境质量标准》(GB 15618—1995)二级标准，且均为S3>S1>S2。

2.2 细菌群落Alpha多样性

反映样本OTU覆盖情况的Coverage指数均在96%以上，表明测序数据较为理想。以97%相似性进行OTUs聚类分析，得到地下水样品的OTUs为GW1(1 761)>GW2(1 426)>GW3(1 244)，土壤样品的OTUs为S1(5 007)>S3(4 490)>S2(4 062)。

选定衡量样品群落多样性的Simpson指数和Shannon指数以及衡量样品群落丰富度的Chao1指数和ACE指数来表征地下水和土壤样品物种组成情况。土壤细菌群落的多样性和丰富度明显高于地下水，其中土壤和地下水细菌群落的Shannon指数和ACE指数差异显著(P < 0.05)。地下水细菌群落以GW1点位的多样性和丰富度最高；土壤细菌群落以S1点位的多样性最高，S2点位的丰富度最高。

2.3 地下水和土壤细菌群落特征

经高通量测序，地下水样品共计得到195 121条高质量基因序列，未能在门、纲、目、科、属和种分类水平上进行分类的基因序列比例分别为0.42%，1.42%，4.58%，7.13%，32.96%和94.56%；土壤样品共计得到181 018条高质量基因序列，未能在门、纲、目、科、属和种分类水平上进行分类的基因序列比例分别为2.96%，5.61%，10.80%，27.66%，52.69%和90.37%。可见，地下水和土壤细菌群落在种分类水平上存在大量的未知类型细菌。

表1 不同点位地下水样品理化性质Table 1 Physical and chemical properties of goundwater samples at different sites

注：ND表示结果低于方法检出限；镉和铜检出限为0.0001 mg·L-1，锌检出限为0.0050 mg·L-1。

Note: ND indicates the result is below the method detection limit; the method detection limit of Cd and Cu was 0.0001 mg·L-1, and the method detection limit of Zn was 0.0050 mg·L-1

表2 不同点位土壤样品理化性质Table 2 Physical and chemical properties of soil samples at different sites

表3 Alpha多样性指数Table 3 Alpha diversity index

经物种注释，地下水样品共检出48个细菌门，土壤样品共检出50个细菌门。图2为门分类水平下各采样点的菌群结构。变形菌门(Proteobacteria)是地下水中的优势细菌门，分别为GW1(73.13%)、GW2(95.68%)和GW3(96.87%)。拟杆菌门(Bacteroidetes；2.01%)和厚壁菌门(Firmicutes；2.97%)是平均丰度排名第2和第3的优势类群。Proteobacteria、Bacteroidetes和Firmicutes占据地下水总细菌丰度的93.54%，其余细菌门相对丰度均低于0.1%。

土壤中丰度前3的优势类群有Proteobacteria(55.19%)、放线菌门(Actinobacteria；14.13%)和酸杆菌门(Acidobacteria；6.46%)，相对丰度高于1%的优势类群还有Firmicutes(5.06%)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes；4.37%)、绿弯菌门(Chloroflexi；3.72%)、硝化螺旋菌门(Nitrospirae；2.58%)、Bacteroidetes(1.92%)和浮霉菌门(Planctomycetes；1.23%)，蓝藻门(Cyanobacteria)、绿菌门(Chlorobi)和疣微菌门(Verrucomicrobia)相对丰度均低于0.1%。

对变形菌门进行细分(图2)，地下水细菌群落中各变形菌纲的平均丰度依次为γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria；47.48%)>β-变形菌纲(Betaproteobacteria；33.68%)>α-变形菌纲(Alphaproteobacteria；5.59%)>δ-变形菌纲(Deltaproteobacteria；1.24%)，土壤细菌群落中各变形菌纲的平均丰度依次为Betaproteobacteria(19.14%)>Gammaproteobacteria(18.65%)>Alphaproteobacteria(9.61%)>Deltaproteobacteria(7.58%)。Gammaproteobacteri和Betaproteobacteria是地下水和土壤细菌群落中排名第1和第2的优势细菌纲。

选取地下水或土壤细菌群落中相对丰度大于1%的优势细菌门和4类变形菌纲进行不同细菌群落间的差异显著性分析(表3)，其中Proteobacteria在地下水和土壤细菌群落间具有显著性差异(P < 0.05)，以地下水细菌群落中占比更高。Actinobacteria、Acidobacteria、Chloroflexi、Nitrospirae和Deltaproteobacteria在地下水和土壤细菌群落间具有显著性差异(P < 0.05)，在土壤细菌群落中丰度更高。Alphaproteobacteria和Gemmatimonadetes在土壤中占比明显高于地下水，在地下水和土壤细菌群落间具有显著性差异(P < 0.01)。

图1 门分类水平下细菌群落组成Fig. 1 Composition bacteria community at the phyla level

图2 变形菌纲相对丰度Fig. 2 Relative abundance of four classes within the Proteobacteria phyla

高通量测序结果表明，地下水和土壤中存在较多种类的细菌属，其中地下水和土壤中分别检出459和594个细菌属，优势细菌属如表4所示，主要为具有解磷或脱氮固氮作用的假单胞菌属(Pseudomonas)、硫杆菌属(Thiobacillus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、Cupriavidus、Rhodoplanes和芽单胞菌属(Gemmatimonas)，能参与有机质矿化和产生抗生素的链霉菌属(Streptomyces)，降解烷烃的Alkanindiges和降解有机物的马赛菌属(Massilia)，以及条件致病不动杆菌属(Acinetobacter)。

表4 优势细菌在地下水和土壤间的差异显著性Table 4 Significance of difference of dominant bacteria in groundwater and soil

注：*表示差异显著(P < 0.05)，**表示差异显著(P < 0.01)。

Note:*represents significant difference (P < 0.05),**represents significant difference (P < 0.01).

表5 地下水和土壤微生物差异属比较Table 5 Comparison on microorganism genera between groundwater and soil

注：N代表样品中未检出此类细菌。

Note: N represents no such bacteria were detected in the samples.

3 讨论(Discussion)

3.1 细菌群落多样性在地下水和土壤中的分布特征

地下水和土壤中的微生物是地下水和土壤生态系统生物地球化学的重要组分，是适用于表征地下水和土壤质量的生物学指标[21]。当前，工业园区场地土壤和地下水污染日趋严重，对区域生态和人居环境健康构成影响[22]。本次通过高通量测序对工业园区地下水和土壤细菌群落进行研究，Alpha多样性结果显示，土壤细菌群落丰度、多样性和丰富度指数对比于地下水细菌群落显著增加，土壤的氮、磷养分高于地下水环境，同时地下水受环境影响较大(表2、表3)，相对来说，土壤处于稳定良好的生态环境中，故其细菌数量较多，种群丰富。S2点位总磷、全氮含量高于其余土壤采样点，同时细菌群落的丰富度也最高，这与Peralta等[23]对湿地土壤细菌群落的研究结果一致，表明细菌群落丰度与各种限制性营养元素的有效利用紧密相关[24-25]。

本次研究的工业园区主要污染源集中在北部的盐化工区及中部工业用地范围内，其中GW3/S3位于工业园区北部(周边建有化工、化肥和制药等环境敏感源)，GW2/S2位于工业园区中部，而GW1/S1位于工业园区南部(周边工业企业较少)。地下水各采样点的OTUs、Shannon指数、Simpson指数、Chao1指数和ACE指数均为GW3

3.2 地下水和土壤细菌群落结构

高通量测序全面反映地下水和土壤细菌群落结构和丰度特征，本研究中Proteobacteria是优势菌门，所占比例分别高达88.56%(地下水)和55.19%(土壤)。同时各变形菌纲(Gammaproteobacteria、Betaproteobacteria、Alphaproteobacteria和Deltaproteobacteria)在地下水和土壤中也占比丰富。由于地下水和土壤生态系统和理化环境的差异致使细菌群落结构出现显著变化，各类优势细菌在不同群落之间存在显著差异(表4)，并具有各自特有的细菌属(表5)。

该工业园区地下水细菌群落中相对丰度大于1%的优势类群有Proteobacteria、Bacteroidetes和Firmicutes，均为淡水环境中常见的优势类群[26-28]。工业园区地下水细菌群落结构特征与博斯腾湖以及太湖等淡水湖泊浮游细菌群落结构的研究结果类似[29-30]，进一步表明该工业园区地下水细菌群落具有典型的淡水种群特征。Pseudomonas是地下水细菌群落属分类水平上最具优势的细菌类群，广泛存在于各种环境(土壤、水及动物活动环境中)中，对营养物质要求低，代谢类型多，代谢能力较强，在自然界和污染环境的矿化修复作用过程中有着重要地位[31]。此次地下水细菌群落中还检出了特有的降解烷烃的Alkanindiges和降解有机物的Massilia，这些细菌属均有利于地下水有机污染物的降解。同时地下水中还检出可引起人体多个部位感染的条件致病菌Acinetobacter，值得引起关注。

细菌群落多样性对于维持土壤生态平衡有着重要作用，种类繁多的细菌类群有益于土壤养分的循环转化，是土壤健康的标志之一，其区域组成和生物量对土壤作物的形成和发育有密切关系。该园区土壤细菌群落组成与黄土高原不同乔木林[32]以及北京市某苹果园(砂质壤土)[33]等多处土壤细菌群落结构组成类似；Proteobacteria、Actinobacteria、Acidobacteria、Firmicutes、Gemmatimonadetes和Chloroflexi等优势细菌类群在园区土壤中占比丰富，在维持着园区土壤生态系统能量的固定、储存、转移和释放中扮演重要角色。土壤氮磷含量是土壤微生物生长的主要来源，土壤中养分充足致使土壤中Actinobacteria、Acidobacteria、Gemmatimonadetes、Chloroflexi和Nitrospirae丰度显著高于地下水。

土壤pH经常被视为支配整个土壤细菌群落和单个细菌群组成的首要因素[24]，有研究表明，变形菌纲是碱性土壤的主要类群[30]，本研究中各变形菌纲在土壤中均占比重较高，而该园区土壤呈弱碱性，表明Proteobacteria是碱性土壤中的优势细菌类群。微生物作用是土壤氮磷形态转化的重要驱动因子，有研究表明，解磷微生物所产生的磷素，不仅可以降低土壤中重金属的活性，同时可以促进作物生长[34]。本次在园区土壤中检出了多种解磷固氮的菌属，多数隶属于Proteobacteria，意味着这类菌群的变化将可能在驱动园区土壤氮磷循环过程和改善土壤环境中发挥重要作用。

综上，本文运用高通量测序分析工业园区地下水和土壤样品，结果表明，样品OTU平均覆盖率高达98%，测序结果较为全面地反映细菌群落组成情况。Alpha多样性结果显示土壤细菌群落多样性和丰富度指数均高于地下水，Shannon指数和ACE指数呈显著差异。该工业园区地下水细菌群落具有典型的淡水种群特征，Proteobacteria、Bacteroidetes和Firmicutes是主要的优势类群，多样性指数比较结果表明地下水环境已受到一定程度污染。土壤中优势细菌门为Proteobacteria、Actinobacteria、Acidobacteria、Firmicutes和Gemmatimonadetes，共占85.21%；隶属于Proteobacteria的固氮解磷菌属可能对园区土壤氮磷循环发挥重要作用。

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