文蛤亮氨酸氨肽酶LAP3的基因克隆及其在幼体不同发育时期、成体不同组织的表达分析

阮文斌，董迎辉，高晓艳，刘晨珊，林德海，林志华*

(1. 浙江万里学院 水产种质资源高效利用技术研究浙江省重点实验室，浙江 宁波 315100；2.上海海洋大学 水产与生命学院，上海 201306)

文蛤亮氨酸氨肽酶LAP3的基因克隆及其在幼体不同发育时期、成体不同组织的表达分析

阮文斌1,2，董迎辉1，高晓艳1，刘晨珊1，林德海1，林志华1*

(1. 浙江万里学院 水产种质资源高效利用技术研究浙江省重点实验室，浙江 宁波 315100；2.上海海洋大学 水产与生命学院，上海 201306)

为探索贝类LAP3基因的结构和功能特征以及在生长发育过程中的作用，利用cDNA末端快速扩增(RACE)法获得文蛤LAP3(Mm-LAP3)基因的cDNA全长序列，并对其生物信息学、组织及发育时期表达特征进行了分析。结果显示，Mm-LAP3基因cDNA全长2 037 bp，ORF区1 254 bp，编码417个氨基酸；Mm-LAP3蛋白由Peptidase_M17超家族序列的N-端结构域和Peptidase_M17催化结构域组成。荧光实时定量PCR结果表明，Mm-LAP3基因在文蛤成体6个组织和幼体10个发育时期中均有表达，其中在斧足中的表达量显著高于其他组织(P<0.05)，这与斧足蛋白含量丰富、代谢旺盛相关；在幼体10个发育时期中的表达量呈现逐渐升高的趋势，在D形幼虫时期达到最高，随后又有所降低，推测Mm-LAP3基因在早期发育时期参与了某些组织器官的形成。

文蛤；亮氨酸氨肽酶(LAP3)；基因克隆；表达分析

1 引言

亮氨酸氨肽酶 (Leucine aminopeptidase 3，LAP3)，是一种蛋白水解酶，能够促进和延长亮氨酸水解，把蛋白质或肽链的N端选择性切割成氨基酸残基，具有促进多肽分解、细胞增殖、细胞生长、调节伤害防御等重要功能[1—3]。它主要是在蛋白质水解后期将各种内肽酶降解产物进一步分解，可使亮氨酸从多肽链的N-末端顺序逐个地游离出来，产生氨基酸和小肽，以实现蛋白质的转化和细胞的动态平衡[1—2]。亮氨酸是动物必须的氨基酸，主要在骨骼肌进行代谢，可以抑制蛋白质降解和促进机体蛋白合成，这可能和亮氨酸代谢的关键酶(支链氨基酸转氨酶和脱氨酶)主要分布在骨骼肌上有关，亮氨酸的缺乏可以引起生长的阻滞[4]。在小鼠上的研究结果表明，高浓度的亮氨酸可以促进小鼠骨骼肌的蛋白质的合成[5]；在草鱼饲料中，适宜添加亮氨酸可以提高其采食量和饲料转化效率，促进其生长[6]；在育肥猪的饲料中添加亮氨酸可显著提高最长肌中的脂肪含量[7]。LAP3基因在动物中已被证实，对细胞生长和机体发育具有重要的研究意义，但在海洋贝类中，有关该基因的研究相对较少，已见Wharam等[8]研究了太平洋牡蛎(Crassostreagigas)单基因序列突变(SNP)对亮氨酸氨肽酶结构和稳定性的影响；Donald等[9]通过荧光实时定量PCR(Q-RT-PCR)技术检测了在太平洋牡蛎胚胎早期发育过程中亮氨酸氨肽酶的活性；Michael等[10]发现紫贻贝(Mytilusedulis)亮氨酸氨肽酶在调节盐度方面发挥着重要作用；董迎辉[11]分析了泥蚶(Tegillarcagranosa)LAP3基因的基因结构和时空表达特征。

文蛤(Meretrixmeretrix)是我国四大传统养殖贝类之一，具有丰富的营养价值和较高的经济价值[12]。目前对文蛤功能基因的研究报道已有一些，主要集中在生长和免疫相关基因，生长相关基因方面有铁蛋白亚基基因(ferritin)[13]、组织蛋白酶B(cathepsinB)[14]、生长因子受体结合蛋白2(GRB2)[15]等，免疫相关基因有热休克蛋白70(hsp70)[16]、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)[17]、C-型凝集素(CTL)[18]，但对LAP3基因的研究却未见报道。本实验克隆获得Mm-LAP3基因的cDNA全长，并利用Q-RT-PCR技术分析了该基因在成体6个组织和幼体10个发育时期的表达量差异，以期为探索该基因在文蛤生长、发育中的作用机理奠定基础，为文蛤优良品种选育提供一定的借鉴作用。

2 材料与方法

2.1 实验材料

实验用文蛤材料取自宁波市鄞州区丹艳水产养殖基地。解剖文蛤成贝，取其闭壳肌、内脏团、外套膜、斧足、水管、鳃6个组织，液氮速冻，-80℃保存备用。2014年7月，通过隔离产卵和人工授精获得同步发育的未受精卵、受精卵、4细胞胚胎、囊胚、原肠胚、担轮幼虫、D 形幼虫、壳顶幼虫、眼点幼虫和稚贝10个发育时期样品，液氮速冻，-80℃保存备用。

2.2 实验方法

2.2.1 Mm-LAP3基因的cDNA全长克隆

利用Trizol法提取文蛤斧足总RNA，SMARTTMRACE cDNA Amplication试剂盒(Clontech)反转录获得cDNA第一链，作为快速扩增的模板。根据Mm-LAP3基因的454转录组文库注释信息，利用Contig序列分别设计3′和5′端RACE特异性引物GSP1和GSP2(表1)，用Advantage 2 Polymerase 试剂盒(Clontech)扩增Mm-LAP3基因的cDNA全长。Touch down PCR进行3′-和5′-RACE扩增。PCR产物经1%琼脂糖电泳检测，割胶回收，回收产物按说明书要求连接到pEASY-T1(全式金)载体，重组质粒转化到感受态细胞(全式金)中进行克隆，菌液PCR后通过检测，选取阳性克隆送公司测序。

表1 实验所用引物汇总

2.2.2 Mm-LAP3基因的序列及进化分析

将测得的序列对比拼接，用NCBI(National Center for Biotechnology Information，NCBI)的BLAST工具验证Mm-LAP3基因cDNA全长的正确性；ORF Finder软件搜索开放阅读框；DNAMAN软件预测其氨基酸序列；ExPASy和ExPASy Protscale软件分别进行蛋白质理化性质和疏水性分析；SignalP和TMHMM分别进行蛋白质信号肽和跨膜分析；SMART4.0和Swiss Model软件分别对蛋白质功能域和高级结构进行预测；Jpred软件预测活性位点；MEGA6.0软件进行氨基酸相似性比对和构建系统进化树。

2.2.3Mm-LAP3基因在不同组织和不同发育时期的表达差异分析

取上述文蛤成体6个组织和幼体10个发育时期样品，Trizol法提取总RNA，按照Promega反转录试剂盒说明合成cDNA第一链，用于Q-RT-PCR的模板，Real-L-F和Real-L-R(表1)为特异性引物，以18SrRNA(表1)基因为内参[15]，利用ABI 7500 FAST荧光定量PCR仪进行Mm-LAP3基因在幼体不同发育时期及成体不同组织的定量表达分析，每个样品设3个平行，数据采用相对值2-ΔΔCt对基因的相对表达水平进行分析，SPSS19.0进行数据统计分析，P<0.05为差异显著，P<0.01为差异极显著。

3 结果

3.1 Mm-LAP3基因cDNA全长克隆

Mm-LAP3基因的cDNA全长2 037 bp(GenBank登录号：KU678388)，开放阅读框1 254 bp，编码417个氨基酸，5′非编码区(5′UTR)351 bp，3′非编码区(3′UTR)432 bp，3′UTR包含一个加尾信号 ATTAAA及27 bp的poly A尾(图1)。

3.2 Mm-LAP3基因序列分析

利用ExPASy Compute推导出Mm-LAP3蛋白的理论分子量为45.64 kDa，理论等电点值6.77。ExPASy Protscale软件预测显示，该蛋白在氨基酸组成上极性氨基酸所占比例较高，表现为亲水性；Signal P软件预测表明，该蛋白没有明显的信号肽；TMHMM软件在线预测，该蛋白不存在跨膜区；利用Jpred软件在Mm-LAP3蛋白中找到两个Zn2+结合活性位点。

利用SMART软件对Mm-LAP3蛋白进行功能域预测(图2)，结果表明，该蛋白含有2个功能域，即Peptidase_M17超家族序列的N-端结构域(2-88aa)和Peptidase_M17催化结构域(96-407aa)。Swiss model软件预测显示，Mm-LAP3蛋白的二级结构由283个H键、14个α-螺旋、16个β-折叠和38 个转角组成，N-端结构域主要存在α-螺旋，Peptidase_M17催化结构域主要存在α-螺旋和β-折叠(图3)。

3.3 Mm-LAP3相似性及系统进化树分析

利用MEGA 6.0软件，对文蛤和其他14个物种进行氨基酸序列比对，比对结果表明，文蛤(Meretrixmeretrix，KU678388)与泥蚶(Tegillarcagranosa，AFP57676.1)的相似性最高为62.2%，与文昌鱼(Branchiostomafloridae，XP_002588073)、热带爪蟾(Xenopustropicalis，NP_001011124.1)、马(Equuscaballus，NP_001296147.1)、褐家鼠(Rattusnorvegicus，NP_001011910.1)、倭黑猩猩(Panpaniscus，XP_003846029.1)、人(Homosapiens，BAG51065.1)等的相似性为55.8%～61.3%。系统进化树分析显示，文蛤先与泥蚶、太平洋牡蛎、加州双斑蛸(Octopusbimaculoides)等软体动物聚成一支，然后与文昌鱼和鲎(Limuluspolyphemus)聚在一起，最后与脊椎动物中的鱼纲、爬行纲、两栖纲、鸟纲和哺乳纲聚成一大支(图4)。

3.4Mm-LAP3在文蛤不同组织和不同发育时期的差异分析

利用Q-RT-PCR技术，检测Mm-LAP3基因在成体6个组织和幼体10个发育时期的时空表达特征。文蛤成体6个组织在自然状态下Mm-LAP3基因在mRNA水平的表达状况见图5(各组织的LAP3基因表达量是相对于水管LAP3基因的表达量)，结果表明，在文蛤不同组织中均有表达，其中斧足中的表达量最高，并与其他组织之间存在显著性差异(P<0.05)。幼体不同发育时期表达结果表明，Mm-LAP3基因在D形幼虫期表达量最高，极显著地高于其他发育时期(P<0.01)，而在担轮幼虫的表达量显著高于除D形幼虫期以外其他时期的表达量，其他时期之间则无显著性差异(P>0.05)(图6)。

4 讨论

亮氨酸氨肽酶3是M1或M17家族的一类蛋白水解酶，在植物和动物中广泛分布，其主要功能是在蛋白质水解后期将各种内肽酶降解产物进一步分解[1—2]。M1和M17的C端均有1个催化结构域，但有着不同的催化机制和结构[19]。M17肽酶是由6个单体组成且不含有金属肽酶模体HEXXH锌结合体motif[20]。本实验获得的Mm-LAP3基因cDNA全长2 037 bp，经结构域与功能域预测，编码417个氨基酸，包括Peptidase_M17超家族序列的N-端结构域(2-88aa)和Peptidase_M17催化结构域(96-407aa)，并且缺失HEXXH锌结合体motif，这说明Mm-LAP3蛋白属于M17肽酶家族成员。至今发现的氨肽酶中有60%都属于金属酶，其中最多的结合离子是Zn2+[21]，本研究通过对Mm-LAP3蛋白高级结构的预测，发现了2个Zn2+结合活性位点，这是M17家族成员的共同特点，在LAP3结合底物并发生催化反应时具有重要作用[22]。

图1 Mm-LAP3基因全长cDNA序列及其氨基酸序列推测Fig.1 The full-length of cDNA sequence of LAP3 gene and deduced amino acid sequence in M. meretrix加框部分分别代表起始密码子、终止密码子和加尾信号，* 代表蛋白翻译结束，斜体加粗的是胞浆氨肽酶位点，灰色阴影部分为N-端结构域，下划线的部分代表Peptidase_M17催化结构域，双下划线是polyA尾巴The letters boxes are the start codon, the stop codon and the polyadenylation signal sequence, the * represents the end of the protein translation, the bold italics is arylaminopeptidase site, the grey shaded part is the functional domains of N-terminal, the underlined part is the functional do-mains of Peptidase_M17, the double underlined part is polyA

图2 用SMART软件预测的Mm-LAP3蛋白的功能域Fig.2 Prediction of protein functional domains of Mm-LAP3 using the SMART software

图3 Mm-LAP3蛋白的二级结构预测Fig. 3 The prediction of Mm-LAP3 protein secondary structure 红色为α-螺旋；黄色为β-折叠；蓝色为转角；白色为其他残基Red represents the alpha-helix, yellow represents the beta sheet, blue represents the turn, other residues are white

图4 基于NJ法构建的LAP3氨基酸序列系统进化树Fig.4 Neighbor-joining phylogenetic tree of LAP3 amino acid sequences

图5 Mm-LAP3基因在文蛤成体6个组织中的表达差异分析(n=3)Fig.5 Analysis of expression difference of Mm-LAP3 gene in six tissues of adult M. meretrix(n=3)1.外套膜，2.鳃，3.内脏团，4.闭壳肌，5.斧足，6.水管, P<0.05 1.mantle, 2.gill, 3. digestive gland, 4. adductor muscle, 5. foot, 6.siphon, P<0.05

图6 Mm-LAP3基因在文蛤幼体10个发育时期的表达差异分析(n>500)Fig.6 Analysis of expression of Mm-LAP3 gene in ten developmental stages of larvae in M. meretrix(n>500)1.未受精卵，2.受精卵，3.4细胞，4.囊胚，5.原肠胚，6.担轮幼虫，7.D形幼虫，8.壳顶幼虫，9.眼点幼虫，10.稚贝，**代表极显著差异，P<0.011.unfertilized mature eggs, 2.fertilized eggs, 3.four cells, 4.blastula, 5.gastrulae, 6.trochophore, 7.D-shaped larva, 8.umbo-larvae, 9.eyebot larva,10.juvenile clams, **represents very significant differences, P<0.01

LAP3作为一种氨肽酶，通过将肽链分解成氨基酸来实现蛋白质的转化和新陈代谢平衡。植物LAP3在调节伤害防御[23]、生长素受体的跨膜转运[24]、减数分裂[25]中具有重要的作用；在哺乳动物中，LAP3具有指示胎盘功能及胎儿成熟度[26]、参与生物活性肽的形成[1-2]、参与血压调节[27]等生理功能。本实验对Mm-LAP3基因在6个组织中的表达情况进行了检测，结果表明该基因在各组织中均有表达，这与在泥蚶中的研究结果相类似[11]，说明Mm-LAP3在文蛤体内多个生命活动中都发挥着重要功能；但不同组织间依然存在一定的差异性，其表达量由高到低依次为：斧足、闭壳肌、内脏团、鳃、外套膜、水管，其中在斧足和闭壳肌中表达量相对较高，而斧足和闭壳肌是文蛤肌肉最发达、蛋白含量最高的部位，由此推测Mm-LAP3可能参与蛋白代谢且与肌肉生长关系密切。内脏团作为主要的消化器官来实现蛋白质的合成与代谢，因此表达量也相对较高。有研究结果表明，亮氨酸可以通过提高mRNA的翻译速度而促进蛋白质的合成[28]，本实验中Mm-LAP3在斧足中表达量最高，正是由于斧足是文蛤肌肉最发达的部位，需要大量的蛋白质，LAP3通过促进和延长亮氨酸水解来提高机体中亮氨酸的含量来促进蛋白质的合成。

在胚胎发育过程中，蛋白质代谢能够促使机体发育发生特殊变化[29]。有体外实验研究表明，亮氨酸是细胞增殖所必需的[30]。Yang等[31]在非洲爪蟾(Xenopuslaevis)胚胎中检测发现氨肽酶从原肠早期出现并在整个胚胎发育期间广泛存在；冯军厂等[32]在草鱼(Ctenopharyngodonidellus)中发现氨肽酶参与了包括细胞生长和信号转导等多种生理生化过程；Donald等[9]对太平洋牡蛎不同发育时期的氨肽酶活性和其基因转录量的变化趋势进行研究，结果表明，LAP基因在浮游幼虫期表达量急剧升高，这可能是贝类为适应环境所做出的生理反应，通过调节LAP蛋白质代谢来加强对外界环境的适应能力。本研究分析了Mm-LAP3在文蛤幼体10个发育时期的表达情况，发现D形幼虫时期的表达量显著高于其他时期，原因可能是D形幼虫是浮游幼虫的重要时期，该期幼虫肌肉快速生长、细胞分裂加速、生命旺盛，且对外界环境的适应能力亟待加强，因此需要更多LAP3蛋白表达；担轮幼虫时期LAP3表达量也较高，可能与文蛤幼虫的肌肉(前闭壳肌和3条幼虫收缩肌)首先出现在担轮幼虫期有关[33—34]。壳顶幼虫时期表达量又有所下降，到稚贝表达量降到最低，这说明在文蛤早期发育过程中，LAP3表达量升高是为了完成发育变态过程，这也与LAP3具有实现蛋白质代谢和转化有关。

5 结论

(1)Mm-LAP3基因包含M17家族特有的Pepti-dase_M17超家族序列的N-端结构域和Peptidase_M17催化结构域，发现2个Zn2+结合活性位点，氨基酸序列比对发现与其他动物具有很高的相似性，说明其序列具有较高的保守性。

(2)对Mm-LAP3基因在成体6个组织中的表达情况进行检测，结果表明该基因在各组织中均有表达，说明Mm-LAP3在文蛤体内多个生命活动中都发挥着重要功能，能够促进和延长亮氨酸水解，其中在斧足中的表达量显著高于其他组织，推测Mm-LAP3可能参与蛋白水解且与肌肉生长关系密切。

(3)对Mm-LAP3基因在幼体10个组织中的表达情况进行检测，结果表明该基因在D形幼虫时期的表达量显著高于其他时期，推测Mm-LAP3在早期发育时期表达量升高是为了完成发育变态过程，促使其肌肉快速生长、细胞分裂加速。

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Gene cloning and expression analysis of leucine aminopeptidase LAP3 gene in different development stages of larvae and different tissues of adult of Meretrix meretrix

Ruan Wenbin1, 2, Dong Yinghui1, Gao Xiaoyan1, Liu Chenshan1, Lin Dehai1, Lin Zhihua1

(1.KeyLaboratoryofAquaticGermplasmResourcesofZhejiang,ZhejiangWanliUniversity,Ningbo315100,China; 2.CollegeofFisheriesandLifeSciences,ShanghaiOceanUniversity,Shanghai201306,China)

To explore the molecular structure and functional characteristics ofLAP3 gene and its role in the process of growth and development, full length cDNA ofLAP3 inMeretrixmeretrix(Mm-LAP3)was cloned by rapid amplification of cDNA ends technique(RACE), then the bioinformatics and expression profiles in different adult tissues and developmental stages of larvae were analyzed. The results showed that the full length cDNA ofMm-LAP3 gene was 2 037 bp, containing a complete 1 254 bp ORF encoding 417 amino acids. There were two functional domains of Mm-LAP3 protein (Peptidase_M17 and N-terminal). The result of Q-RT-PCR indicated thatMm-LAP3 expressed in six tissues and ten developmental stages, but the expression of foot was significantly higher than other tissues. The expression ofMm-LAP3 gradually increased with the process of the development, and showed the highest in D-shaped larvae stage, and then the expression decreased, which suggested thatMm-LAP3 may be involved in the formation of certain organs in early developmental stages.

Meretrixmeretrix; leucine aminopeptidase; gene cloning; expression analysis

10.3969/j.issn.0253-4193.2017.02.009

2016-04-27；

2016-11-24。

国家自然科学基金项目(31372527)；国家现代贝类产业技术体系项目(CARS-48)；国家水产种质资源平台运行服务项目(2015DKA30470)；苏北科技专项(BN2015059)。

阮文斌(1990—)，男，浙江省宁波市人，主要从事海洋贝类分子遗传育种研究。E-mail：wbruan@163.com

*通信作者：林志华，男，研究员，主要从事贝类遗传育种研究。E-mail:zhihua9988@126.com

Q785

A

0253-4193(2017)02-0096-09

阮文斌，董迎辉，高晓艳，等. 文蛤亮氨酸氨肽酶LAP3的基因克隆及其在幼体不同发育时期、成体不同组织的表达分析[J].海洋学报，2017，39(2)：96—104,

Ruan Wenbin, Dong Yinghui, Gao Xiaoyan, et al. Gene cloning and expression analysis of leucine aminopeptidase LAP3 gene in different development stages of larvae and different tissues of adult ofMeretrixmeretrix[J]. Haiyang Xuebao，2017，39(2)：96—104, doi:10.3969/j.issn.0253-4193.2017.02.009