MicroRNA-93对胶质瘤癌细胞侵袭和转移的影响及其作用机制研究

赵焱，彭翔，黄风云

（华中科技大学附属武汉市普爱医院神经外科，湖北武汉430032）

临床论著

MicroRNA-93对胶质瘤癌细胞侵袭和转移的影响及其作用机制研究

赵焱，彭翔，黄风云

（华中科技大学附属武汉市普爱医院神经外科，湖北武汉430032）

目的探讨microRNA-93（miR-93）对胶质瘤细胞侵袭和转移的影响及其初步机制研究。方法检测转化生长因子受体2（TGF-βR2）在胶质瘤标本中的表达，进行miRNA表达谱分析，并进行荧光素酶验证，识别结肠癌中靶向TGF-βR2 miRNAs。体内外分析miRNA介导TGF-βR2表达下调对胶质瘤侵袭性的影响。结果胶质瘤中TGF-βR2表达下降。TGF-βR2是胶质瘤高侵袭性的标志物。胶质瘤中靶向TGF-β R2的主要miRNAs是miR-17-92及其同系物miR-93，其中miR-93的差异最大。miR-93介导TGF-βR2下调会导致胶质瘤细胞侵袭能力下降。结论miR-93通过下调TGF-βR2表达，抑制胶质瘤细胞的侵袭和转移。

胶质瘤；侵袭；转移；miR-93；转化生长因子受体2

转化生长因子-β（transforming growth factorβ，TGF-β）信号在不同肿瘤阶段发挥的作用也不同，既能发挥肿瘤抑制作用，也能发挥肿瘤促进作用，具体发挥哪种功能，可能与肿瘤类型及肿瘤所处阶段有关[1]。microRNA（miRNA）是调节基因表达的重要因子，可以通过诱导翻译抑制和/或蛋白质编码基因的mRNA，降解调节多种生物过程。miR-93属于miR-17-92miRNA簇的旁系同源miRNA（miR-106b-25），在多种类型肿瘤中表达下调，miR-93靶基因包括LASTS2、AICDA、ITGB8、PTEN、VEGFA、TP53INPI及DAB2等[2]，提示miR-93可通过多种机制发挥抑癌作用，但miR-93在胶质瘤中的作用尚不明确。有研究表明，胶质瘤中转化生长因子受体2（transforming growth factor receptor 2，TGF-βR2）表达升高[3]。尽管有多种miRNAs，例如miR-26a、miRNA-18a、miR-18b、miR-218、miR-216b、miR-663、miR-155、miR-205及EBV编码miRNAs等，参与胶质瘤的发生、发展[4]，但是尚未证实其与靶向TGF-βR2表达有关。本研究采用miRNA表达谱分析胶质瘤中miRNA表达特征，并根据TGF-βR2表达水平进行分层，分析与TGF-βR2相关的miRNAs，以期为胶质瘤治疗提供潜在的新靶点。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选取2008年1月-2010年12月在本院神经外科就诊的胶质瘤患者138例，均经手术治疗，手术前未接受放化疗及其他治疗，经病理确诊均为胶质瘤，取其癌组织标本。其中，男性75例，女性63例；年龄32～75岁，平均58岁。所有患者接受定期随访，直至死亡或随访结束（截止2013年12月）。评价随访期为48.2（6～58）个月。患者定期接受身体检查、超声检查，如有必要进行CT扫描。总生存期是指手术至死亡间隔时间。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养本实验共选择373-MG、U87-MG、U251和SHG44 4种人胶质瘤细胞株和HEB正常人脑胶质细胞株，该细胞均采用含10％小牛血清，100 u/ml青链霉素的1640培基，在37℃、5％二氧化碳CO2培养箱内培养，取生长状态良好的细胞用于实验。

1.2.2 胶质瘤组织及细胞总RNA提取使用美国Invitrogen公司Trizol试剂盒提取总RNA。称取100mg胶质瘤组织和正常癌旁组织，或1 ml胶质瘤细胞株悬液，常温下加裂解液1 ml筛网研磨，吸取裂解液后加氯仿混匀。4℃离心后留取上清液约400μl，加入等体积聚合液后混匀倒入内套管，经2次洗脱液洗脱，4次高速离心交叉进行后，将内套管移入新的离心管，在膜中央加洗脱液去RNA酶水，静置、离心后获得总RNA。分光光度仪检测260/280在1.8～2.2。

1.2.3 miRNA表达谱分析取5μg胶质瘤组织总RNA通过YM-100（Millipore）微离心过滤柱，得到片段＜300 nt的miRNA，Poly（A）聚合酶在分离到miRNA 3'端加上poly（A）尾巴，再将一寡聚核苷酸标记与该poly（A）尾巴连接用于后续的荧光标记。使用特异性荧光标记Cy3标记胶质瘤RNA样品。miRNA杂交使用含有25％甲酰胺的100μ16×乙二胺四乙酸磷酸钠盐缓冲液（25％甲酰胺，NaCl 0.90 mol/L，Na2HPO4160 mmol/L，乙二胺四乙酸6 mmol/L，pH 6.8），34℃通过微循环泵杂交仪器在ParafloTM微流体芯片上杂交过夜，漂洗甩干后，采用Gene Pixo 4000B（美国Molecular Devices公司）激光共聚焦扫描仪采集杂交图像，采用Array-Pro（美国Media Cybernetics公司）软件对杂交图像进行数字化转换，计算两种检测信号的比值和t检验的P值，分析差异有统计学意义的表达位点。采用双通道miRNA芯片，芯片内每个探针杂交布置≥3个重复。

1.2.4 实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative realtime polymerase chain reaction，qRT-PCR）检测胶质瘤组织和细胞中TGF-βR2 mRNA和miR-93表达qRT-PCR采用北京艾德莱miRNA Real-time PCR Assay kit实时定量反应体系，美国ABI-step one PCR仪进行扩增反应。以U6为内参，检测TGF-βR2 mRNA和miR-93的表达，TGF-βR2mRNA和miR-93的正反向引物。反应体系总体积为20μl，其中含有2×miRNA qPCR Mix（With Sybr Green）10μl，Forward primer 0.4μl，Reverse primer 0.4μl，miRNA 0.5μl，其余用ddH2O补齐反应体系。PCR反应条件：94℃预变性3 min，94℃变性20 s，60℃退火20 s，72℃继续延伸40 s，共40个循环，获得CT值。

1.2.5 免疫组织化学法（immunological histological chemistry，IHC）检测TGF-βR2在胶质瘤组织中的表达将组织蜡块4μm连续切片，切片脱蜡至水，在3％过氧化氢-微波-甲醇中浸泡10 min以灭活内源性过氧化氢酶，采用枸椽酸-微波-链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连接法在10 mmol/L枸橼酸（pH 6.0）中煮沸5 min，保温10 min，10％羊血清封闭。即用型PV900试剂盒和二氨基联苯胺显色剂（购自北京中杉生物技术公司），兔抗人TGF-βR2多克隆抗体（购自英国Abcam公司）。磷酸盐缓冲液代替一抗作阴性对照，TGF-βR2阳性表达的结肠癌肝转移切片作阳性对照。随机读取有代表性的10个高倍镜视野观察阳性细胞。每个视野计数100个肿瘤细胞，采用双评分半定量法进行评分。①根据染色程度：无着色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。②按阳性细胞百分比评分：不着色为0分，＜25％为1分，25％～50％为2分，＞50％为3分。以两者积分相加为该片得分：0～2分为阴性表达，3～6分为阳性表达。

1.2.6 细胞转染200 pmol mir-93mimics/scramble mimics或mir-93 inhibitors/scramble inhibitors用300μl无血清改良伊格尔培养基（dulbecco's modified eagle medium，DMEM）培养液稀释，同样将5μl脂质体2 000用300μl无血清DMEM培养液稀释混匀，两种稀释液室温静置5 min。随后，稀释后的200 pmol mir-93 mimics/scramble mimics或mir-93 inhibitors/scramble inhibitors和脂质体2000混合，总体积为600μl，用移液器轻微吹打混匀，常温放置1h，使Mimics和脂质体有足够时间形成复合物。取300μl Mimics和脂质体复合物加入6孔板中，水平振荡器上轻微晃动培养板，继续培养常规培养4 h，将用含血清和抗生素培基更换掉转染培养基，继续常规培养。48 h后胰酶消化收集细胞，用于后续试验分析鉴定。

1.2.7 TGF-βR2 3’UTR和mut-3’UTR报告基因载体的荧光素酶活性分析①TGF-βR2 3’UTR和mut-3’UTR序列设计。根据Targetscan软件分析结果，并结合TGF-βR2 3’UTR与miR-93结合位点，设计TGF-βR2 3’UTR的克隆序列。TGF-βR2 3’UTR，PmeⅠ正向引物：5’-CCGGTTTAAACATCG CTCGAGCAGCAGGGAGTGGGTGACAT-3’，反向引物：SgfⅠ：5’-CGCATCGCGGCCGCTGGCTGTGAGA CATGGAGCCGATCCCCTAGGCAATTTACACGC-3’。扩增的TGF-βR2 3’UTR序列为ATTGCCTACATT TATCATGGGATCCCCTAGGGTCAAATAAACACTGG TAAGCTTCCCATTTATCCCTACATTGGTCGTTTAAA CGTG，含PmeⅠ和SgfⅠ酶切位点，以及miR-93种子区与TGF-βR2 3’UTR的结合位点。同时构建TGF-βR2 3’UTR的突变克隆（TGF-βR2 mut-3’UTR），其3’UTR中3’UTR与miR-93种子区结合的3’端序列TCAAATAAACACTGGTAAGCTT，突变成ATGCCATAACACTGCGCAAAGC。②TGF-βR2 3’-UTR和TGF-βR2 mut-3’UTR报告基因载体的设计。将TGF-βR2 3’UTR和TGF-βR2 mut-3’UTR克隆到psi-CHECK-2质粒海肾荧光素酶（以下简称Renilla）基因下游的PmeⅠ和SgfⅠ位点之间，构建psi-CHECK-TGF-βR2-3’UTR质粒和psi-CHECKTGF-βR2-mut-3’UT质粒。双荧光素酶报告基因载体的工作原理是psi-CHECK-2质粒带有萤火虫素酶基因和Renilla基因，miRNA与靶mRNA互补结合后，导致Renilla基因转录受阻，Renilla蛋白合成障碍，海肾荧光减弱，作为标准化参照萤火虫荧光素（以下简称Firefly）酶的表达则不受影响，从而使海肾荧光素酶活性/萤火虫荧光素酶活性（Renilla/Firefly）比值下降。

1.2.8 细胞侵袭和转移分析Transwell侵袭小室上室面铺以细胞外基质胶，小室下室加入500μl完全干细胞培养基，胶质瘤细胞转染48 h后，分别加入100μl上述各组实验细胞悬液，放入37℃培养箱孵育24 h，取出Transwell小室后，小室下室加入结晶紫500μl，染色20 min后用自来水清洗终止，在荧光倒置显微镜下观察和计算穿过小室的细胞数目。每组实验重复3次。

1.3 统计学方法

数据分析采用SPSS 19.0统计软件，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，用t检验，计数资料以率表示，用χ2检验。生存曲线用Kaplan-Meier法绘制，并用Log-rank检验进行组间生存率比较，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TGF-βR2上调与胶质瘤侵袭相关

2.1.1 TGF-βR2在胶质瘤组织中的表达采用qRT-PCR检测50例胶质瘤和癌旁正常组织中TGF-βR2 mRNA的表达，经t检验，差异有统计学意义（t=18.278，P=0.000），胶质瘤组织中TGF-βR2 mRNA高于相应癌旁正常组织（见图1）。

2.1.2 TGF-βR2蛋白在胶质瘤组织中的表达TGF-βR2阳性表达为棕黄色颗粒产物，主要定位于细胞浆，呈弥漫分布。阳性表达染色指数在复发转移组与无复发转移两组间比较，差异有统计学意义，转移复发组高于无转移复发组（见附表和图2）。其确诊时的年龄比较，经t检验，差异无统计学意义（t=0.609，P=0.612）。经Kaplan-Meier生存分析和对数秩和检验（Log-rank），结果表明，TGF-βR2阳性表达组生存率低于阴性表达组，差异有统计学意义（P=0.000）（见图3）。

图1 qRT-PCR检测TGF-βR2 mRNA在胶质瘤组织中的表达（x±s）

2.1.3 胶质瘤细胞株中TGF-βR2 mRNA和蛋白的表达TGF-βR2 mRNA和蛋白在4种胶质瘤细胞株中的表达高于正常胶质细胞。TGF-βR2 mRNA和蛋白在胶质瘤中的表达明显上调。与转移性和侵袭性较低的胶质瘤细胞株（U251和SHG44）相比，侵袭性和转移性更强的胶质瘤细胞株（373-MG和U87-MG）TGF-βR2 mRNA和蛋白表达增强（见图4），结果表明，TGF-βR2表达上调与胶质瘤侵袭性相关。

2.2 miR-93在胶质瘤中下调TGF-βR2的表达

2.2.1 胶质瘤中miR-93表达与TGF-βR2表达的关系miRNA表达谱分析结果表明，与其他两组标本比较，TGF-βR2 mRNA高表达组miR-93、miR-20a、miR-20b及miR-18a的表达明显发生变化，这4种miRNA都属于miR-17-92基因簇及其旁系同源miRNA（见图5）。

2.2.2 TGF-βR2作为miR-93靶基因的信息学分析本研究采用RNA hybrid和Target Scan对miR-93靶基因进行预测，结果显示，miR-93种子序列与TGF-βR2的3’UTR具有互补性（见图6）。随后的双-荧光酶素报告分析发现，miR-93+TGF-β R2 wt 3’UTR荧光素酶活性与miR-93+TGF-βR2 mt 3’UTR，经t检验，差异有统计学意义（t=3.648，P=0.001），miR-93会严重减弱TGF-βR2 wt 3’UTR报告载体的荧光酶素活性，而miR-93对TGF-βR2 mt 3’UTR突变位点报告载体的荧光酶素活性无影响，提示miR-93通过3’UTR与TGF-βR2结合直接调节TGF-βR2表达（见图7）。

附表不同影响因素间TGF-βR2表达阳性率的比较

图2 TGF-βR2蛋白在胶质瘤组织中的表达

2.2.3 miR-93 mimics/inhibitors转染对胶质瘤细胞株TGFβR2表达的影响TGF-βR2在373-MG细胞中表达相对较高，而在U251细胞中表达相对较低。将miR-93抑制物和模拟物分别转染373-MG和U251细胞，结果发现，TGF-βR2 mRNA和蛋白表达水平在373-MG细胞中都有所降低（t=3.447，P= 0.001），而在U251细胞中升高（t=3.936，P=0.001）（见图8），表明miR-93在胶质瘤中直接抑制TGF-βR2的表达。

图3 Kaplan-Meier生存分析TGF-βR2表达与患者生存期的相关性

图4 胶质瘤细胞株中TGF-βR2 mRNA和蛋白的表达（x±s）

图5 胶质瘤miRNA表达谱差异分析

2.3 miR-93介导TGF-βR2表达下调对胶质瘤侵袭性的影响

图6 miR-93种子序列与TGF-βR2的3’UTR具有互补性

图7 miR-93对TGF-βR2 wt 3’UTR和TGF-βR2 mt 3’UTR双-荧光酶素报告载体荧光活性的影响

图8 MiR-93 mimics/inhibitors转染对胶质瘤细胞株TGF-βR2表达的影响

细胞侵袭和转移分析表明，miR-93模拟物抑制373-MG细胞侵袭和转移，而miR-93抑制物促进U251细胞侵袭和转移。进一步研究表明，利用siRNA方法敲除TGFβR2表达，能够抑制373-MG细胞的增殖和转移能力（见图9）。本研究结果提示，miR-93通过下调TGF-βR2表达，抑制胶质瘤细胞转移和侵袭。

图9 miR-93调控TGF-βR2表达对胶质瘤细胞侵袭和转移的影响

3 讨论

本研究主要探讨miR-93和TGF-βR2在胶质瘤患者中的表达及其临床意义。目前研究证实，TGF-β R2在多种肿瘤发生中的作用。HAN等[5]研究表明，TGF-βR2在胶质瘤中异常高表达。TGF-βR2表达在胶质瘤细胞中可能通过多种机制表达上调，如TGF-βR2启动子异常激活[6-7]，以及本文中所研究的miRNA调控。miR-17-92及其旁系同源基因是目前研究较为广泛的miRNA基因簇，其在正常发育中起关键作用，miR-17-92表达调控异常会导致包括肿瘤在内的多种疾病。有研究在临床样本中采用全局miRNA表达谱分析后发现，鼻咽癌组织中没有任何一种miRNAs能够靶向TGF-βR2，与其他研究结果相似[8-10]。然而，本研究基于该miRNA表达谱数据对胶质瘤临床样本分类，将胶质瘤分为TGF-βR2高表达、低表达组及正常对照组，结果发现与TGF-β R2相关的miRNAs基因簇（miR-93、miR-20a、miR-20b及miR-18a）都属于miR-17-92基因簇及其旁系同源基因。

另有少量研究表明，miR-17-92基因簇及其旁系同源基因在肿瘤细胞中参与TGF-βR2功能调控。miR-17-5p和miR-21能够在HCT116 p53-null人类结肠癌细胞中抑制TGF-βR2[11]。JIANG等[12]也用荧光酶素报告分析实验证实，TGF-βR2是miR-20a的靶基因。最近研究发现，miR-93的某些潜在靶基因可以在多种癌症中调控肿瘤形成及癌变过程[13-14]。本研究发现，TGF-βR2是miR-93主要靶点，可以介导胶质瘤中的致瘤作用。

本研究采用体内外和临床分析等综合手段探讨miR-93介导TGF-βR2表达下调在胶质瘤发生、发展中的作用，根据多组临床数据提出假说并支持本研究结论。总之，胶质瘤中miR-93介导TGF-βR2下调能够抑制胶质瘤细胞侵袭。

[1]刘本鲲.TGF-β在肿瘤微环境中多重作用的研究进展[J].实用肿瘤学杂志,2015,29(5):454-457.

[2]FANG L,DENG Z,SHATSEVA T,et al.MicroRNA miR-93 promotes tumor growth and angiogenesis by targeting integrin-β8[J]. Oncogene,2011,30(7):806-821.

[3]曹泽,金贵善,刘福生,等.TGF-β2/Smad2在人脑胶质瘤组织中的表达及意义[J].中华临床医师杂志:电子版,2012,6(6):43-46.

[4]康春生,浦佩玉,贾志凡,等.人脑胶质瘤细胞系miRNA表达谱初步研究[J].中华神经外科杂志,2008,24(6):468-470.

[5]HAN J,ALVAREZ-BRECKENRIDGE C A,WANG Q E,et al. TGF-βsignaling and its targeting for glioma treatment[J]. American Journal of Cancer Research,2015,5(3):945-955.

[6]WANG H,PAN J Q,LUO L,et al.NF-κB induces miR-148a to sustain TGF-β/Smad signaling activation in glioblastoma[J]. Molecular Cancer,2015,14(1):1.

[7]杜理安,黄红光,詹仁雅,等.神经细胞NCAM及TGF-β2在脑胶质瘤中表达的意义[J].实用肿瘤杂志,2003,18(4):295-298.

[8]LYU X,FANG W,CAI L,et al.TGF-βR2 is a major target of miR-93 in nasopharyngeal carcinoma aggressiveness[J].Molecular Cancer,2014,13(1):1.

[9]MA Z L,HOU P P,LI Y L,et al.MicroRNA-34a inhibits the proliferation and promotes the apoptosis of non-small cell lung cancer H1299 cell line by targeting TGF-βR2[J].Tumor Biology,2015,36(4):2481-2490.

[10]SRIRAM S,ROBINSON P,PI L,et al.Triple combination of siRNAs targeting TGF-β1,TGF-βR2,and CTGF enhances reduction of collagen i and smooth muscle actin in corneal fibroblaststriple sirnas reduce scarring gene expression[J].Investigative Ophthalmology Visual Science,2013,54(13):8214-8223.

[11]YU Y,KANWAR S S,PATEL B B,et al.MicroRNA-21 induces stemness by downregulating transforming growth factor beta receptor 2(TGF-βR2)in colon cancer cells[J].Carcinogenesis,2012,33(1):68-76.

[12]JIANG Z,YIN J,FU W,et al.MiRNA 17 family regulates cisplatin-resistant and metastasis by targeting TGF beta R2 in NSCLC[J].PloS One,2014,9(4):DOI:10.1371/journal.pone. 0094639.

[13]FU X,TIAN J,ZHANG L,et al.Involvement of microRNA-93, a new regulator of PTEN/Akt signaling pathway,in regulation of chemotherapeutic drug cisplatin chemosensitivity in ovarian cancer cells[J].FEBS Letters,2012,586(9):1279-1286.

[14]HELLER G,WEINZIERL M,NOLL C,et al.Genome-wide miRNA expression profiling identifies miR-9-3 and miR-193a as targets for DNA methylation in non-small cell lung cancers[J]. Clinical Cancer Research,2012,18(6):1619-1629.

（童颖丹 编辑）

TGFβR2 is a major target of miR-93 in glioma motility and invasiveness

Yan Zhao,Xiang Peng,Feng-yun Huang
(Department of Neurosurgery,the Affiliated Puai Hospital,Huazhong University of Science and Technology,Wuhan,Hubei 430032,China)

ObjectiveTo investigate the effect of miR-93 on motility and invasiveness of glioma cells and its mechanism.MethodsThe expression of transforming growth factor receptor 2(TGFβR2)in clinical samples was evaluated.A miRNA expression profiling analysis was carried out,which was followed by multi-validations including luciferase reporter assay,and identification of miRNAs targeting TGFβR2 in glioma cells.In vitroandin vivostudies were performed to further investigate the effect of miRNA-mediated TGFβR2 downregulation on glioma cells aggressiveness.Finally,the associated pathway and genes influenced by this miRNA-mediated TGFβR2 down-regulation were explored.ResultsTGFβR2 was down-regulated in more than 50％of the glioma patients.It was an unfavorable prognosis factor contributing to clinical aggressiveness of glioma.A cluster of 4 TGFβR2-associated miRNAs was identified.The main miRNAs targeting TGFβR2 in glioma were miR-17-92 and its homologue miR-93,of which miR-93 was the most significant one.miR-93 mediated down-regulation of TGFβR2 decreased the invasiveness of glioma cells.ConclusionsThe present study reports involvement of miR-93-mediated TGFβR2 down-regulation in glioma aggressiveness,thus giving extended insights into molecular mechanisms underlying cancer aggressiveness.

glioma;metastasis;invasiveness;miR-93;transforming growth factor receptor 2

R739.41

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.01.013

1005-8982（2017）01-0064-07

2016-05-18

黄风云，E-mail：106926899@qq.com