绞股蓝总苷对PCSK9基因表达及辛伐他汀降血脂作用的影响*

吴柳松， 钱民章

(遵义医学院 1生物化学教研室， 2附属医院小儿内二科，贵州 遵义 563004)



绞股蓝总苷对PCSK9基因表达及辛伐他汀降血脂作用的影响*

吴柳松1,2， 钱民章1△

(遵义医学院1生物化学教研室，2附属医院小儿内二科，贵州 遵义 563004)

目的： 探讨绞股蓝总苷(gypenosides， GPs)对大鼠肝脏前蛋白转化酶枯草溶菌素9(PCSK9)基因表达及辛伐他汀的降血脂作用的影响。方法: 采用高脂饲料喂饲建立大鼠高脂血症模型。60只健康雄性SD大鼠随机分为正常对照组(control组)、高脂模型组(model组)、辛伐他汀组(simvastatin组)、GPs组和GPs与辛伐他汀联合用药组(combined组)。除正常对照组喂食普通饲料外，其余3组大鼠均喂食高脂饲料。将GPs溶于0.3%羧甲基纤维素钠(CMC-Na)溶液中，用灌胃方式给药。Control组和model组灌0.3% CMC-Na(1 mL/100 g)，GPs组灌GPs 160 mg·kg-1·d-1，simvastatin组灌辛伐他汀5 mg·kg-1·d-1，combined组灌两者联合剂量。实验8周后，处死大鼠。取腹腔动脉血，测定血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)；称大鼠体重及肝脏组织湿重，测定肝指数；取肝脏用4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，HE染色作常规形态学检测；另取肝脏提取总RNA，real-time PCR测定PCSK9和低密度脂蛋白受体(LDLR)的mRNA表达；提取肝脏总蛋白，Western blot测定PCSK9和LDLR蛋白的表达。结果: 成功建立高脂血症大鼠模型。与model组大鼠比较，simvastatin组、GPs组以及combined组TC、TG和LDL-C水平均明显下降(P<0.05)，各组HDLC水平有不同程度的上升(P<0.05)。与model组大鼠比较，simvastatin组、GPs组以及combined组肝指数均明显下降(P<0.05)。肝组织病理结果显示，高脂血症性大鼠出现脂肪肝病变；simvastatin组、GPs组以及combined组大鼠肝细胞脂肪变性程度有不同程度减轻，尤以combined组效果显著。与model组比较，simvastatin组PCSK9和LDLR的mRNA表达均明显升高，GPs组以及combined组PCSK9 的mRNA表达明显降低(P<0.05)，GPs组LDLR的mRNA表达变化不明显，combined组LDLR的mRNA表达明显升高(P<0.05)。与model组比较，simvastatin组PCSK9和LDLR的蛋白表达均明显升高；GPs组和combined组的PCSK9 蛋白表达明显降低，LDLR 蛋白表达明显升高(P<0.05)。结论: GPs能抑制肝脏PCSK9表达，增加LDLR表达量；与辛伐他汀联用可增强其降血脂和减轻肝脏脂肪病变的效果。

绞股蓝总苷； 高脂血症；PCSK9 基因； 低密度脂蛋白受体； 辛伐他汀

高脂血症(hyperlipidemia，HL)是指血脂高于正常参考值的上限的现象，是由多种原因导致脂蛋白合成与清除平衡紊乱所致。越来越多的研究发现，一些基因缺陷或表达失衡，使参与脂蛋白合成、转运和代谢的受体、酶或载脂蛋白异常，导致血脂升高[1]。高脂血症是引起动脉粥样硬化、脑中风等心脑血管疾病的重要原因，利用药物控制血脂水平，可以减少心脑血管疾病的发病率，具有重要的临床意义[2]。2003年，Seidah等[3]发现一个新基因——前蛋白转化酶枯草溶菌素9(proprotein convertase subtilisin/kexin 9，PCSK9)基因，该基因编码一种前蛋白转化酶，名为神经细胞凋亡调节转化酶1(neural apoptosis-regulated convertase 1，NARC-1)，可介导低密度脂蛋白受体(low-density lipoprotein receptor，LDLR)降解，升高血浆中低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)的水平，该基因的各种突变会导致异常胆固醇血症。他汀类是目前临床上最常用的降脂药物，降脂效果得到认可，但也存在部分副作用[4]。新近的研究发现，他汀类药物在降脂的同时，能增强PCSK9表达，从而增强LDLR降解，使他汀类药物降脂效果受到抑制[5]。

绞股蓝是葫芦科绞股蓝属的多年生草质藤本植物，其主要药效成分为绞股蓝总苷(gypenosides，GPs)。动物实验发现，GP及GPs均能明显降低实验性高脂大鼠总胆固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)、LDL-C、极低密度脂蛋白(very-low-density lipoprotein，VLDL)和过氧化磷脂，同时升高高密度脂蛋白胆固醇(high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C)，使高脂血症得到明显改善[6-8]。临床试验也证实，GPs可显著降低血脂水平，有调节血脂代谢的作用[9-10]。GPs是否能通过影响PCSK9的表达发挥降脂效应以及与辛伐他汀联用能否拮抗辛伐他汀对PCSK9的诱导作用而增强其降脂效果，未见报道。为此，本实验建立了高脂血症大鼠模型，对上述问题进行了研究。

材 料 和 方 法

1 实验动物

SPF级雄性SD大鼠60 只，体重(200±20) g，购自第三军医大学大坪医院实验动物中心，合格证号为SCXK(渝)2012-0005。分笼喂养于室温下明暗各12 h的动物饲养室内，饮水不限。

2 主要实验材料

绞股蓝总苷(纯度98.06%)购自西安赛邦医药科技有限公司;辛伐他汀分散片(广州南新制药有限公司)；TRIzol(Invitrogen)；PCSK9、LDLR和GAPDH引物(上海生工生物工程公司)；RT-PCR试剂盒(TaKaRa)；兔抗人抗PCSK9和LDLR抗体(Abcam);兔抗人抗β-actin抗体(北京博奥森生物技术有限公司)；辣根过氧化物酶标记山羊 II 抗(北京博奥森生物技术有限公司)；PMSF/RIPA裂解液(碧云天生物技术研究所)；丙烯酰胺(Solarbio)；PVDF膜(Millipore)；Tris(Solarbio)。

3 主要仪器设备

核酸蛋白分析仪(Thermo)；普通PCR仪(Eppendorf)；实时荧光定量PCR仪(CFX96)、酶标仪、凝胶成像系统、垂直电泳-转膜装置(Bio-Rad)；超低温冰箱(海尔公司)；超纯水系统(Millipore)；电子天平(Tokyo)；高速冷冻离心机(Eppendorf)。

4 主要方法

4.1 实验分组及模型建立 大鼠适应性喂养(喂食普通饲料)1周后，随机分为空白对照组(control组)、高脂模型组(model组)、辛伐他汀组(simvastatin组)、绞股蓝总苷组(GPs组)和绞股蓝总苷与辛伐他汀联合用药组(combined组)5组。Control组以基础饲料喂养，其余各组均以高脂饲料(配方为：10%猪油、2%胆固醇、5%蔗糖、0.5%胆盐、0.2%丙硫氧嘧啶和82.3%基础饲料)喂养。根据人体实验剂量和成人与大鼠的体重折算系数折算成大鼠用药量。造模同时灌胃给GPs和辛伐他汀，GPs剂量为每天160 mg/kg，辛伐他汀剂量为每天5 mg/kg，combined组以两者联合剂量给药；control组和model组每天灌服0.3%的CMC-Na，每周称重1次用以调整灌胃量，连续给药8周。

4.2 动物处置及标本采集 实验末次给药后，禁食12 h，不禁水，称体重，7%水合氯醛皮下麻醉，腹主动脉采血5 mL。将大鼠处死后，迅速剥取其全部肝脏，用预冷4 ℃的生理盐水反复冲洗，直到未见淤血，用滤纸吸干，做好标记并称重、拍照。标本采集完后，所剩动物尸体按有关要求进行处置。

4.3 大鼠血脂的测定 将采集的大鼠血液4 ℃、3 000 r/min离心15 min，分离血清，全自动生化分析仪测定TC、TG、HDL-C和LDL-C。

4.4 大鼠肝指数的测定 按肝指数(%)=肝脏湿重/大鼠体重×100%，计算各组大鼠肝指数。

4.5 大鼠肝脏病理学检测 取部分肝脏组织4%多聚甲醛固定24 h，梯度乙醇脱水透明后，石蜡包埋，切片经梯度乙醇脱蜡至水合，常规HE染色，显微镜下观察肝脏病理学变化。

4.6 Real-time PCR检测大鼠肝脏PCSK9和LDLR的mRNA表达 在冰上将肝脏组织用TRIzol试剂匀浆至无明显组织颗粒，并按TRIzol试剂盒操作要求提取肝脏总RNA，按RT-PCR试剂盒操作进行反转录。扩增的cDNA加入至20μL的反应体系中。PCSK9的上游引物序列为5’-GCACTGGAGAACCACACAGG-3’，下游引物序列为 5’-TGGCTGCATGACATTGCTTCTC-3’；LDLR的上游引物序列为5’-CCTCAGCTACCAGCACCTCT-3’，下游引物序列为5’-AGCCATGTCACCTTGGACTT-3’；GAPDH的上游引物序列为5’-GGCATTGCTCTCAATGACAA-3’，下游引物序列为5’-ATGTAGGCCATGAGGTCCAC-3’。逆转录条件为：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。Real-time PCR的反应条件为:95 ℃ 3 min；95 ℃ 5 s，59.5 ℃ 30 s，39 个循环。以GAPDH作为内参照，目的基因PCSK9和LDLR的表达根据经real-time PCR仪器检测的Ct值，通过公式2-ΔΔCt计算相对表达量。

4.7 Western blot法检测大鼠肝脏PCSK9和LDLR蛋白的表达 在冰上将肝脏组织用细胞裂解液匀浆至无明显组织颗粒，静置充分裂解，离心后取上清，用BCA法测定蛋白浓度，蛋白定量120 μg，煮沸5 min，上样于10% SDS-PAGE胶电泳1.5 h，全湿式电转将分离胶上的蛋白转移到PVDF膜上。室温下用含5%脱脂奶粉封闭1 h。加入I抗(兔抗鼠PCSK9和LDLR多克隆抗体，1∶1 000；兔抗鼠β-actin抗体,1∶5 000)及 II 抗(1∶5 000)，化学发光检测目的条带，在凝胶成像系统上观察分析并拍照。用目的蛋白与内参蛋白的灰度值之比计算蛋白的相对表达量。

5 统计学处理

实验数据以均值±标准差(mean±SD)表示，采用SPSS 17.0软件进行统计分析，资料经正态性及方差齐性检验后，进行单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验法，以P<0．05表示差异有统计学显著性。

结 果

1 GPs对高血脂模型大鼠血清血脂水平的影响

各组大鼠血清经全自动生化分析仪检测其血脂水平，结果显示与正常对照组比较，模型组大鼠血清TC、TG和LDL-C水平均明显升高，差异有统计学显著性(P<0．05)，HDL-C水平则明显下降，差异也具有统计学显著性(P<0．05)。与模型组大鼠比较，辛伐他汀组、GPs组以及联合用药组TC、TG和LDL-C水平均明显下降，差异有统计学显著性(P<0．05)，其HDL-C水平均明显升高，差异也具有统计学显著性(P<0．05)。辛伐他汀组与GPs组比较，以上指标差异均无统计学显著性；而与两者单独用药比较，联合用药组大鼠血清TC、TG和LDL-C水平均明显降低(P<0．05)，HDL-C水平明显升高(P<0．05)，见图1。

2 GPs对高血脂模型大鼠肝指数变化的影响

各组大鼠肝指数测定结果显示，与正常对照组大鼠比较，模型组大鼠肝指数明显升高，差异有统计学显著性(P<0．05)。与模型组大鼠比较，辛伐他汀组、GPs组以及联合用药组肝指数均明显下降，差异均有统计学显著性(P<0．05)，辛伐他汀组与GPs组肝指数差异无统计学显著性，而与两者单独用药比较，联合用药组大鼠肝指数则明显下降，差异有统计学显著性(P<0．05),见图2。

Figure 1. The levels of blood lipids in different groups of the rats. Mean±SD.n=12.*P<0．05vscontrol group;▲P<0．05vsmodel group;★P<0．05vscombined group.

图1 各组大鼠血清的血脂水平

3 GPs对高血脂模型大鼠肝脏病理学变化的影响

3.1 肉眼观察 Control组大鼠肝脏均无明显异常，颜色红润，质地柔软，富有弹性；model组大鼠肝脏呈灰白色脂肪病变,体积呈弥漫性增大，边缘钝而厚实，质地变硬，指压可出现凹陷，切面有油腻感；辛伐他汀组、GPs组以及联合用药组脂肪病变明显减轻，呈淡红色，色泽较暗，质地、弹性及切面油腻感等介于control组与model组之间，但此3组之间肉眼观察变化不太明显，见图3。

Figure 2.The change of liver index in different group of the rats. Mean±SD.n=12.*P<0．05vscontrol group;▲P<0．05vsmodel group;★P<0．05vscombined group.

图2 各组大鼠肝指数的变化

Figure 3.The macroscopic observation of the liver in different groups of the rats.

图3 各组大鼠肝脏肉眼观察

3.2 镜下病理学观察 Control组的肝细胞索排列较整齐，以中央静脉居中，肝窦正常不增宽，胞核清晰，肝小叶轮廓不明显，未见结缔组织，肝细胞内仅可见少量细小脂滴。 模型组的肝细胞严重肿胀，病变仍以中央静脉为中心，可见大量脂肪空泡，脂滴大小不等，部分融合为大泡性脂肪变性，肝窦狭窄或消失，部分区域见有点状坏死、脂肪变性的细胞布满视野，肝细胞排列松散。辛伐他汀组的病变程度较模型组明显减轻，可见少量小脂滴，肝细胞肿胀较模型组也较轻，胞浆疏松化，可见到正常的肝细胞。GPs组也可见肝细胞脂肪变性，但较model组明显减轻，肝细胞肿胀较model组也较轻，与辛伐他汀组比较区别不明显。联合用药组可见脂肪病变程度较model组、辛伐他汀组及GPs组明显减轻，细胞空泡变明显减少致未见，脂滴少而小，接近正常组，肝细胞核结构基本正常，偶见少数无核肝细胞。细胞肿胀程度较模型组肿胀显著减少，略重于正常组，见图4。

Figure 4.The pathological observation of the liver in different groups of the rats (HE staining, ×200).

图4 各组大鼠肝脏的病理学观察

4 GPs对高血脂模型大鼠肝脏PCSK9和LDLR的mRNA表达的影响

Real-time PCR检测各组大鼠肝脏PCSK9和LDLR的mRNA表达，结果显示与正常对照组比较，高脂模型组PCSK9的mRNA表达明显升高，LDLR的mRNA表达明显降低，差异均有统计学显著性(P<0.05)。与高脂模型组比较，辛伐他汀组PCSK9和LDLR的mRNA表达升高，差异有统计学显著性(P<0.05)；GPs 组PCSK9的mRNA表达明显降低，差异有统计学显著性(P<0.05)，LDLR的mRNA表达差异则无统计学显著性；combined组PCSK9的mRNA表达同样明显降低，LDLR的mRNA表达则明显升高，差异均有统计学显著性(P<0.05)。与GPs组及simvastatin组比较，combined组PCSK9和LDLR的mRNA表达均介乎单独两组之间，且差异均有统计学显著性(P<0.05)，见图5。

Figure 5.The mRNA expression of PCSK9 and LDLR in the rat liver of different groups. Mean±SD.n=12.*P<0.05vscontrol group;▲P<0.05vsmodel group;★P<0.05vscombined group.

图5 各组大鼠肝脏PCSK9和LDLR mRNA的表达

5 GPs对高血脂模型大鼠肝脏PCSK9和LDLR 蛋白表达的影响

Western blot法检测各组大鼠肝脏PCSK9和LDLR蛋白的表达，结果显示与正常对照组比较，高脂模型组PCSK9的蛋白表达明显升高，LDLR的蛋白表达明显降低，差异有统计学显著性(P<0.05)。与高脂模型组比较，simvastatin组的PCSK9和LDLR 蛋白表达均明显升高，差异有统计学显著性(P<0.05)；GPs组的PCSK9蛋白表达明显降低，LDLR蛋白表达明显升高，差异均有统计学显著性(P<0.05)；combined组的PCSK9蛋白表达明显降低，LDLR蛋白表达明显升高，差异均有统计学显著性(P<0.05)。与GPs组及simvastatin组比较，combined组的PCSK9蛋白表达均低于单独两组各自的蛋白表达值，差异有统计学显著性(P<0.05)，combined组的LDLR蛋白表达则均高于单独两组各自的蛋白表达值，差异也有统计学显著性(P<0.05)，见图6。

Figure 6.The protein expression of PCSK9 and LDLR in the rat liver of different groups. Mean±SD.n=12.*P<0.05vscontrol group;▲P<0.05vsmodel group;★P<0.05vscombined group.

图6 各组大鼠肝脏PCSK9和LDLR 蛋白的表达

讨 论

本实验通过喂饲高脂饮食建立大鼠高脂血症模型，结果显示与空白对照组比较，模型组大鼠TG、TC和LDL-C水平明显升高。此外，模型组大鼠肝指数与空白对照组比较也明显升高；病理学检查也证实肝脏具有明显脂肪病变，这些结果说明大鼠高脂血症模型构建成功。

实验结果表明，与模型组比较，GPs组的TC、TG和LDL-C水平均明显下降，肝指数明显降低，肝脏脂肪病变较模型组也有明显减缓和改善。这些结果与既往文献报道相符，进一步证实了绞股蓝总苷具有降低血脂、减轻肝脂肪变性的作用。

PCSK9不同类型的突变，对血浆胆固醇水平有不同的调节作用[11-12]。基于以PCSK9为靶点的降脂药物研发已受到关注[11,13-14]。本实验中，与模型组比较，GPs组大鼠肝脏PCSK9 mRNA及蛋白的表达均明显下降，LDLR蛋白水平较模型组则明显升高，提示GPs能抑制PCSK9的表达，减少LDLR的降解，从而增加LDL-C的清除，是其降脂的机理之一。另外，与模型组比较，GPs组大鼠肝脏LDLR mRNA的变化不明显，说明GPs对LDLR的转录没有影响。这提示PCSK9对LDLR转录也没有影响，其对LDLR表达调控是发生在蛋白水平，属转录后水平调控，与Wang等[15]和Fisher等[16]报道一致。

辛伐他汀是目前最强效和最常用的降脂药物之一，该药是胆固醇合成的关键酶HMG-CoA还原酶的抑制剂，可抑制内源性胆固醇合成[17]。本实验设置辛伐他汀组作为阳性对照，并设置了辛伐他汀与GPs两者联合用药组，目的是观察GPs对辛伐他汀降脂效应的影响。结果表明辛伐他汀组大鼠血清中TC、TG和LDL-C水平较模型组大鼠均明显下降，虽然其下降的幅度大于GPs组，但两组之间比较差异没有统计学显著性，尚不能确定辛伐他汀降血脂作用是否强于GPs；combined组大鼠血清中的TC、TG和LDL-C水平较模型组大鼠也明显下降，且均强于单独用药组，差异也具有统计学显著性，提示辛伐他汀和GPs在降血脂效应上具有协同作用。

新近的研究发现，他汀类药物在降脂的同时，能增强PCSK9表达，从而增加LDLR降解，使他汀类药物降脂效果受到抑制[5]。而在PCSK9基因敲除鼠中，使用他汀类药时，其LDLR的量明显高于野生型鼠，血脂对降脂药的敏感性增高[18]。本实验结果显示，辛伐他汀组PCSK9和LDLR 的mRNA及蛋白表达与模型组比较均明显升高，说明辛伐他汀能增强LDLR 的表达，从而可降低LDL-C水平，起到降血脂作用。然而在本实验中，辛伐他汀也同时增强了PCSK9基因的表达，这与文献报道一致[5]。Combined组与model组比较PCSK9蛋白表达明显降低，LDLR蛋白表达明显升高；与GPs组及simvastatin组单独用药组比较，combined组PCSK9蛋白表达均低于单独两组的PCSK9蛋白表达值，差异具有统计学显著性，combined组的LDLR蛋白表达则均高于单独两组的LDLR蛋白表达值，差异也具有统计学显著性，表明二者联用后，可能由于GPs抑制了辛伐他汀单独治疗导致的PCSK9表达增加，减少了LDLR的降解，故降脂效果明显优于单用。这提示GPs有可能作为他汀类降脂治疗的补充，增强和改善他汀类药物降脂的疗效。本研究为GPs的降脂治疗提供了新的实验依据和思路。

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(责任编辑： 林白霜， 罗 森)

Effects of gypenosides on PCSK9 gene expression and blood lipids lowered by simvastatin

WU Liu-song1,2, QIAN Min-zhang1

(1DepartmentofBiochemistry,2TheSecondDepartment,Pediatrics,AffiliatedHospitalofZunyiMedicalCollege,Zunyi563004,China.E-mail:qian_mzh@hotmail.com)

AIM: To explore the effect of gypenosides (GPs) onPCSK9 gene expression in hyperlipidemic rat liver and the blood lipids lowered by simvastatin.METHODS: Healthy male SD rats (n=60) were randomized into 5 groups: normal control group, hyperlipidemic model group, simvastatin group, GPs group and GPs combined with simvastatin group (combined group). The rats in all groups were fed high-fat diet except normal control group which were fed with ordinary diet. The rats in control group and hyperlipidemic model group were gavaged with 0.3% CMC-Na every day. The rats in GPs group were gavaged with GPs at 160 mg·kg-1·d-1. The rats in simvastatin group were gavaged with simvastatin at 5 mg·kg-1·d-1. The rats in combined group were gavaged with GPs and simvastatin. The experiment lasted for 8 weeks. The rats were anesthetized with chloral hydrate, and abdominal arterial blood samples were collected to detect the total cholesterol (TC), triglyceride (TG), low-density lipoprotein cholesterol (LDL-C) and high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C). The body weight and the wet weight of the livers were measured, and the liver index was calculated. The pathological changes of the livers were observed under microscope with HE staining. The expression of PCSK9 and low-density lipoprotein receptor (LDLR) at mRNA and protein levels was determined by real-time PCR and Western blot. RESULTS: The model of hyperlipidemia rats was established successfully. Compared with model group, the levels of TC, TG and LDL-C in simvastatin group, GPs group and combined group were obviously decreased (P<0.05), and the HDL-C levels were obviously upregulated (P<0.05). Compared with model group, the liver indexes in simvastatin group, GPs group and combined group were obviously decreased (P<0.05). The pathological changes of the liver tissues showed that hepatic adipose appeared in model group, and that in simvastatin group and GPs group had different degrees of relief, especially in combined group. Compared with model group, the mRNA expression levels of PCSK9 and LDLR in simvastatin group were obviously increased, while the mRNA expression levels of PCSK9 in GPs group and combined group were obviously decreased (P<0.05), and the mRNA expression of LDLR in combined group was obviously increased (P<0.05). Compared with model group, the protein expression of PCSK9 and LDLR in simvastatin group was obviously increased, while the protein expression levels of PCSK9 in GPs group and combined group were obviously reduced, and the LDLR protein levels were obviously increased (P<0.05). CONCLUSION: Gypenosides inhibit the expression of PCSK9 and increase the expression of LDLR in the liver. The combination of gypenosides and simvastatin promotes the lipid-lowering effect of simvastatin and attenuates hepatic steatosis, which may be related to inhibiting the expression of PCSK9 in the liver.

Gypenosides; Hyperlipidemia;PCSK9 gene; Low-density lipoprotein receptor; Simvastatin

1000- 4718(2017)01- 0079- 07

2016- 01- 28

2016- 08- 09

贵州省科技厅基金资助项目(黔科合J字【2009】2-178号)

R543.5

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.01.013

杂志网址： http://www.cjpp.net

△通讯作者 Tel: 0851-28609792； E-mail: qian_mzh@hotmail.com