血管紧张素Ⅱ 2型受体拮抗剂EMA401对神经性疼痛模型大鼠的镇痛效应及机制研究*

肖韩艳， 张本卓， 韩丽萍， 徐 凤

(牡丹江医学院第二附属医院 1神经内科， 2儿科， 3老年病科，黑龙江 牡丹江 157011)



血管紧张素Ⅱ 2型受体拮抗剂EMA401对神经性疼痛模型大鼠的镇痛效应及机制研究*

肖韩艳1， 张本卓1， 韩丽萍2， 徐 凤3△

(牡丹江医学院第二附属医院1神经内科，2儿科，3老年病科，黑龙江 牡丹江 157011)

目的： 观察血管紧张素Ⅱ 2型受体拮抗剂EMA401对坐骨神经慢性压迫性损伤(chronic constriction injury，CCI)模型大鼠的镇痛效应及背根神经节(dorsal root ganglion，DRG)生长相关蛋白43(growth-associated protein-43，GAP-43)、蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)和钙调素(calmodulin，CaM)表达的影响。方法: 采用SD大鼠建立CCI模型，随机分为4组：模型组(model组)，给予等体积生理盐水灌胃；低剂量组，按照EMA401 5 mg/kg剂量灌胃；中剂量组，按照EMA401 10 mg/kg剂量灌胃；高剂量组，按照EMA401 20 mg/kg剂量灌胃。另设假手术组，给予等体积生理盐水灌胃。各组于术前、术后7 d、14 d和28 d同一时间测定热缩足反射潜伏期(thermal withdrawal latency，TWL)和机械缩足阈值(mechanical withdrawal threshold，MWT)行为学指标。行为学检测完毕后，各组大鼠取腰段DRG，采用邻甲酚酞络合铜微板法检测DRG内Ca2+浓度，采用Western blotting和RT-PCR分析检测DRG内GAP-43、PKC和CaM蛋白和mRNA的相对表达量。结果: 与model组比较，EMA401显著升高CCI大鼠TWL和MWT(P<0.05)；与model组比较，EMA401显著降低DRG内Ca2+浓度及GAP-43、PKC、CaM蛋白和mRNA的相对表达量(P<0.05)。结论: EMA401对CCI大鼠具有明显的镇痛效应，其机制可能与抑制DRG内Ca2+浓度及GAP-43、PKC、CaM表达有关。

EMA401； 神经性疼痛； 生长相关蛋白43； 蛋白激酶C； 钙调素

神经性疼痛(neuropathic pain)是由于多种诱因引起的外周或中枢神经系统最初的损伤或功能紊乱而导致的慢性疼痛，患病率为1%～8%，临床上可表现为烧灼痛和痛觉异常、自发性疼痛、痛觉过敏等，其患病率高，病因复杂，严重影响患者的生活质量[1-2]。近年来，神经性疼痛机制存在多种学说，其中以中枢敏化学说研究较多，但是具体机制仍然不清。中枢敏化是产生神经性疼痛敏感的重要原因，具有存在上扬现象和长时程增强效应(long-term potentiation，LTP)的特点。

已知血管紧张素II(angiotensin II，Ang II)参与了神经性疼痛的机制。EMA401是一种新型小分子高选择性血管紧张素II 2型受体(angiotensin II type 2 receptor，AT2R)拮抗剂，对神经性疼痛具有明显的镇痛作用[3]。据报道，EMA401可通过抑制脊髓背根神经节(dorsal root ganglion，DRG)内Ang II/神经生长因子(nerve growth factor，NGF)/瞬时受体电位香草酸受体1(transient receptor potential vanilloid subfamily member 1，TRPV1)信号通路而对神经性疼痛产生镇痛效应[4]。但是，关于EMA401与神经性疼痛中枢敏化的关系鲜见报道。故此，本研究通过建立坐骨神经慢性压迫性损伤(chronic constriction injury，CCI)模型，观察EMA401对神经性疼痛的镇痛效应，并且进一步观察其对DRG内Ca2+浓度及蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)、钙调素(calmodulin，CaM)和生长相关蛋白43(growth-associated protein-43，GAP-43)表达的影响，探讨EMA401对神经性疼痛的镇痛效应的可能机制，为其临床应用提供理论依据。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 实验动物 健康SPF级雄性SD大鼠60只，体重(200±20)g，自由摄食饮水，光照周期12 h/12 h，室温(20±2)℃，湿度40%～60%饲养。由哈尔滨医科大学动物实验中心提供，实验动物合格证号为P00102008。

1.2 药物和试剂 EMA401(Spinifex)纯度>99.0%，以生理盐水配制成2 g/L溶液，4 ℃储存，备用；Ca2+检测试剂盒(北京百奥莱博科技有限公司)；小鼠抗大鼠GAP-43抗体、CaM多克隆抗体、PKC多克隆抗体、兔抗GAPDH多克隆抗体和过氧化物酶标记的IgGⅡ抗(Santa Cruz)；ECL化学发光试剂盒(中杉金桥公司)；二喹啉酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白定量试剂盒(北京原平皓生物技术有限公司)；RT-qPCR试剂盒(上海生物科技公司)。

1.3 主要仪器 Vonfrey 测痛套件(DanMic Glo-bal)；热辐射测痛仪(IITC Life Science)；紫外分光光度计(普析通用公司)；PCR仪(Thermofisher Scientific)；电泳仪(Bio-Rad)。

2 方法

2.1 CCI模型制备及分组 SD大鼠60只，分别沿大鼠脊柱L5～L6节段处做一约3 cm纵向正中皮肤切口，将肌肉做钝性分离，暴露出椎骨，去除棘突和椎板。将20 mL注射器针头缓慢穿入L5/L6椎间隙，以大鼠出现一过性甩尾或后肢抽动作为针头穿过硬脊膜的标准。PE-10导管(注满生理盐水)通过针头送入蛛网膜下腔至L5～L6节段脊髓腰段处，固定导管，依次将肌肉和皮肤进行缝合。置管3 d后，选取无出现运动障碍的大鼠鞘内注射2% 利多卡因20μL。如注药30 s后，未出现双下肢麻痹，舍去；如注药30 s后，出现双下肢麻痹表示置管成功。共成功45只，正常饲养5 d，用于实验。采用随机数字表法，将置管成功的45只大鼠随机分为5组(n=9)：假手术组(sham组)，消毒后麻醉，只暴露坐骨神经，但不结扎，灌胃给予等剂量生理盐水， 每天2次，共28 d；CCI模型组(model组)，消毒后麻醉，暴露坐骨神经并结扎，结扎强度以不完全阻断血管为宜，灌胃给予等剂量生理盐水， 每天2次，共28 d；EMA401治疗组，消毒后麻醉，暴露坐骨神经并结扎，结扎强度以不完全阻断血管为宜，分为低剂量(low dose, LD)组、中剂量(medium dose, MD)组、高剂量(high dose, HD)组，分别按照5 mg/kg、10 mg/kg、20 mg/kg灌胃给予EMA401， 每天2次，共28 d[5]。

2.2 疼痛行为学检测

2.2.1 热缩足反射潜伏期(thermal withdrawal latency，TWL)的测定 各组大鼠于术前24 h测定TWL作为基础痛阈，术后7 d、14 d和28 d再分别测定TWL。测定时间固定于上午8∶00～12∶00，室温维持在(25.0±0.5)℃。使用ⅡTC热辐射测痛仪测定TWL。评价标准：用热辐射测痛仪照射模型大鼠跖部，从照射开始直到大鼠出现缩腿回避反射的时间作为TWL。将大鼠放置在透明有机玻璃检测箱中(20 cm×20 cm×20 cm)，检测箱的底部为2 mm的普通玻璃板，待模型大鼠安静30 min以适应检测箱环境。测定开始时，将辐射灯头从检测箱底部的玻璃板以一定的距离照射大鼠一侧后肢跖部中后1/3处，当大鼠该侧出现缩腿回避反射时，记录时间，即为TWL。热辐射强度在整个实验过程中保持一致，如TWL超过30 s，测痛仪自动关闭，防止灼伤大鼠，TWL记录为30 s。每只大鼠测定3次，每次间隔时间30 min，取其平均值。

2.2.2 机械缩足阈值(mechanical withdrawal thres-hold，MWT)的测定 各组大鼠于术前24 h测定MWT作为基础痛阈，术后7 d、14 d、28 d再分别测定MWT。测定时间固定于上午8：00～12：00，室温维持在(25±0.5)℃。使用Vonfrey 测痛套件测定MWT。评价标准：大鼠出现抬足或舔足行为视为阳性反应，Vonfrey纤维丝弯曲90°无抬足反应为阴性。将大鼠放置在透明有机玻璃检测箱中(22 cm×12 cm×22 cm)，检测箱的底部为金属筛网，待模型大鼠安静30 min以适应检测箱环境。用von Frey 纤维丝(压力值依次为0.41、0.52、0.87、1.16、2.05、3.61、5.50、8.28、10.33和15 g)垂直刺激大鼠一侧后肢跖部中部，持续时间不要超过30 s，初始刺激压力值2.05 g，如果出现阴性反应，则选择高一级压力值；如果出现阳性反应，则选择低一级压力值，依此类推，直至出现第一次阳性和阴性反应的压力值(最大压力值为15 g，大于15 g时，记录为15 g)，再连续测定3次，每次间隔时间30 min。计算每只大鼠的50 %机械缩足反应阈值(内推法)作为MWT，50 %机械缩足阈值=10logX+κδ(X代表最后一次刺激压力值；κ代表不同刺激方式的系数，到内推法的表格中查找对应的值；δ=0.179，代表刺激压力值取对数后间距的平均值)。

2.3 细胞内Ca2+浓度检测 疼痛行为学检测完毕后，每组取3只大鼠，腹腔注射10%水合氯醛(300 mg/kg)麻醉，行左心室-主动脉插管，经管依次37 ℃生理盐水200 mL快速冲洗， 37 ℃ PBS(含4%多聚甲醛)350 mL灌流。迅速取出左侧L5～L6背根神经节，加入RIPA裂解液和PMSF蛋白酶抑制剂，冰上研磨，10 000 r/min 4 ℃离心10 min，取上清。按照Ca2+检测试剂盒[邻甲酚酞络合铜(o-cresolphthalein complexone，OCPC)微板法]说明书检测细胞内Ca2+浓度。配置Ca2+及考马斯亮蓝G250蛋白标准品检测工作液，分光光度计于575 nm处检测各组吸光度(A)，以空白调零。Ca2+浓度(mol/g)=A测定/A标准×2.5/考马斯亮蓝G250蛋白标准品浓度(mg/L)。每份样品检测3次。

2.4 Western blotting分析蛋白表达 疼痛行为学检测完毕后，每组取大鼠3只，取L5～L6DRG。BCA法测定总蛋白浓度。取30 μg蛋白上样后进行10% SDS-PAGE。当电泳完成后，电转至0.45 μm PVDF膜上，5%脱脂奶粉PBST(含25 mol/L、150 mol/L NaCl和0.1% Tween 20)4 ℃封闭2 h。然后加入小鼠抗大鼠GAP-43抗体、CaM多克隆抗体和PKC多克隆抗体(1∶1 000稀释；对照组以PBS代替Ⅰ抗)4 ℃孵育过夜。PBST洗涤后，加入生物素标记的山羊抗兔第Ⅱ抗体(1∶2 000稀释；对照组以PBS代替第Ⅱ抗体)室温孵育2 h。PBST洗涤 5 min、3次，ECL化学发光试剂显色，Bio-Rad凝胶成像系统对各组条带进行灰度值及统计分析。GAPDH抗体孵育方法与上述方法相同，蛋白的相对表达强度=目标蛋白灰度值/GAPDH蛋白灰度值。每份样品检测3次。

2.5 RT-PCR分析mRNA表达 疼痛行为学检测完毕后，每组取大鼠3只，取L5～L6DRG。TRIzol试剂提取细胞总RNA，检测RNA纯度，按照反转录试剂盒说明进行cDNA逆转录。利用Pubmed查找相关基因序列，并利用引物合成软件Primer Premier 5.0设计引物。GAP-43的上游引物序列为5’-TGCCTGCTGCTGTCACTGA-3’，下游引物序列为5’-GGCAGGAGAGACAGGGTTCA-3’，扩增产物片段为254 bp；PKC的上游引物序列为5’-CCGCCTCTACTTTGTGAT-3’，下游引物序列为5’-CCTTGCGTTCGAGTTTCT-3’，扩增产物片段为592 bp；CaM的上游引物序列为5’-TGGCTACCCACCCTTTTATG-3’，下游引物序列为5’-CTTGATCTGCTCGCTCACTG-3’，扩增产物片段为115 bp；GAPDH的上游引物序列为5’-TACAACCTTCTTGCAGCTCC-3’，下游引物序列为5’-ACAATGCCGTGTTCAATGG-3’，扩增产物片段为245 bp。反应体系为RT-PCR酶混合物2.0 μL。反应条件为：94 ℃ 5 min； 94 ℃ 30 s, 59 ℃ 30 s, 72 ℃ 60 s，共32个循环。用1.5%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙啶染色。Gel Doc 1000成像系统进行图像扫描和条带灰度值分析。相对mRNA表达水平=目的基因条带灰度值/GAPDH条带灰度值。每份样品检测3次。

3 统计学处理

采用GraphPad Prism 5.0软件进行描述性统计。计量资料用以均数±标准差(mean±SD)表示。首先对数据的正态分布和方差齐性进行检验，经检验所有数据符合正态分布，继之多组间均数比较，采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，组间两两比较，采用Bonferroni校正的t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 疼痛行为学检测结果

各组大鼠术前的TWL和MWT之间比较，差异无统计学显著性。Model组大鼠术后全部出现了舔舐、悬空、足呈轻度外翻状、跛行等疼痛行为学表现，TWL和MWT均显著降低，与术前和sham组比较，差异具有统计学意义(P<0.05)。LD组、MD组和HD组7 d、14 d和28 d 的TWL和MWT均显著升高，与model组比较，差异具有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 各时点每组大鼠TWL和MWT的变化

*P<0.05,**P<0.01vsbefore surgery;#P<0.05,##P<0.01vssham group;△P<0.05,△△P<0.01vsmodel group.

2 DRG内Ca2+浓度的检测结果

Model组大鼠DRG内的Ca2+浓度显著升高，与sham组比较，差异具有统计学意义(P<0.01)。LD组、MD组和HD组DRG内的Ca2+浓度显著降低，与model组比较，差异具有统计学意义(P<0.05)，见图1。

3 Western blotting分析结果

Model组大鼠DRG内的GAP-43、PKC 和 CaM均呈高表达，与sham组比较，差异有统计学意义(P<0.01)。LD、MD和HD组DRG内的GAP-43、PKC和CaM表达量均显著降低，与model组比较，差异具有统计学意义(P<0.05)，见图2。

Figure 1.The Ca2+concentration detected by OCPC microplating method. Mean±SD.n=9.**P<0.01vssham group;#P<0.05,##P<0.01vsmodel group.

图1 EMA401对Ca2+浓度的影响

Figure 2.The protein levels of GAP-43, PKC and CaM detected by Western blotting. Mean±SD.n=9.**P<0.01vssham group;#P<0.05,##P<0.01vsmodel group.

图2 EMA401对GAP-43、PKC和CaM蛋白表达的影响

4 RT-PCR分析结果

Model组大鼠DRG内GAP-43、PKC 和 CaM的mRNA均呈高表达，与sham组比较，差异具有统计学意义(P<0.01)。LD、MD和HD组DRG内GAP-43、PKC和CaM的mRNA表达量均显著降低，与model组比较，差异具有统计学意义(P<0.05)，见图3。

Figure 3.The mRNA expression of GAP-43, PKC and CaM detected by RT-PCR. Mean±SD.n=9.**P<0.01vssham group;#P<0.05,##P<0.01vsmodel group.

图3 EMA401对GAP-43、PKC和CaM mRNA表达的影响

讨 论

EMA401是一种通过阻断Ang II而治疗神经疼痛的药物，目前已经进入II期临床研究阶段，可使58%的实验组患者平均疼痛强度较前下降30%，而且具有很好的安全性，最大耐受量(maximum tolerated dose，MTD)可达400 mg。本研究中，model组TWL和MWT均显著升高，说明神经性疼痛模型制备成功。参照文献[3]并根据临床给药途径和给药时间，按照体表面积折算后，按照10 mg/kg给予EMA401灌胃给药，并增设5 mg/kg和20 mg/kg 2组，结果表明，EMA401可使CCI大鼠TWL和MWT显著延长。以上结果说明，EMA401确实对神经性疼痛具有镇痛效应，可以抑制痛觉过敏，与文献报道相一致。

研究证实，神经性疼痛和神经系统可塑性功能的主要表现模式——LTP密切相关[6]。LTP与神经元的生长发育、损伤和再生有关的GAP-43常常作为神经可塑性的分子标志。GAP-43是神经发育和再生过程中与轴突生长有关的内在决定因子和标志性蛋白，参与轴突和突触形成，在生长的神经中GAP-43表达增多，可作为神经生长的标志[7-9]。有研究表明，GAP-43是参与形成神经性疼痛过敏的基础之一，GAP-43的表达增加，引起痛觉过敏和超敏，参与和维持LTP[10]。另外，GAP-43除了参与细胞排粒作用、靶细胞识别、神经递质释放、轴突生长及转运以及突触建立、再生和功能调节外，其磷酸化状态与LTP的建立和维持关系密切，进而对突触的可塑性产生影响[11]。GAP-43含有一个与CaM结合域同源的“IQ”序列，从而使其具备调节Ca2+流量和CaM的能力，GAP-43与CaM的动力学结合/离解过程在神经生长、出芽、再生、突触形成过程中扮演重要角色[12]。当伤害性刺激传入末梢所释放的兴奋性氨基酸(如谷氨酸)兴奋DRG，突触后膜内游离Ca2+增多，激活钙蛋白酶、磷脂酶C等多种钙依赖酶，随后钙贮存库释放细胞内Ca2+，Ca2+浓度进一步升高，GAP-43/CaM解离，激活PKC对GAP-43的磷酸化，诱发LTP。

本研究发现，EMA401可使DRG内Ca2+浓度降低，GAP-43、PKC和CaM表达均降低，其机制可能是EMA401阻断AT2R，减少Ca2+内流，导致DGR内GAP-43/CaM不易解离，从而抑制PKC活性，进而使GAP-43释放水平降低，LTP得到抑制，最终缓解神经性疼痛。

综上所述，EMA401对神经病理性疼痛大鼠有良好的镇痛效应，其机制可能与其降低DRG内Ca2+浓度，从而降低GAP-43、PKC和CaM的表达有关。

[1] 叶永贤，林 洪，沙 漠，等. 神经病理性疼痛大鼠脊髓NF-κB、NR2B和iNOS的表达及意义[J]. 中国病理生理杂志，2014，30(4):598-602.

[2] Nascimento OJ, Pessoa BL, Orsini M, et al. Neuropathic pain treatment: still a challenge[J]. Neurol Int, 2016, 8(2):6322.

[3] Smith MT, Wyse BD, Edwards SR. Small molecule angiotensin II type 2 receptor (AT2R) antagonists as novel analgesics for neuropathic pain: comparative pharmaco-kinetics， radioligand binding, and efficacy in rats[J]. Pain Med, 2013, 14(5):692-705.

[4] Anand U, Yiangou Y, Sinisi M, et al. Mechanisms underlying clinical efficacy of angiotensin II type 2 receptor (AT2R) antagonist EMA401 in neuropathic pain: clinical tissue andinvitrostudies[J]. Mol Pain, 2015, 11:38.

[5] Anand U, Facer P, Yiangou Y, et al. Angiotensin II type 2 receptor (AT2R) localization and antagonist-mediated inhibition of capsaicin responses neurite outgrowth in human and rat sensory neurons[J]. Eur J Pain, 2013, 17(7):1012-1026.

[6] Ohnami S, Kato A, Ogawa K, et al. Effects of milnacipran, a 5-HT and noradrenaline reuptake inhibitor, on C-fibre-evoked field potentials in spinal long-term potentiation and neuropathic pain[J]. Br J Pharmacol, 2012, 167(3):537-547.

[7] Grasselli G, Mandolesi G, Strata P, et al. Impaired sprouting and axonal atrophy in cerebellar climbing fibres followinginvivosilencing of the growth-associated protein GAP-43[J]. PLoS One, 2011, 6(6):e20791.

[8] 姜月华， 马度芳， 杨金龙， 等. 交感神经损毁导致的心肌损伤及桂枝汤的保护作用[J].中国病理生理杂志, 2015, 31(4):750-754.

[9] 冷玉芳， 高翊博， 白 洁. 腹腔联合注射氯胺酮及可乐定对CCI模型大鼠的镇痛效应[J].中国疼痛医学杂志, 2011, 17(5):304-308.

[10]Williams S, Mmbaga N, Chirwa S. Dopaminergic D1 receptor agonist SKF 38393 induces GAP-43 expression and long-term potentiation in hippocampusinvivo[J]. Neurosci Lett， 2006, 402(1-2):46-50.

[11]Bekar E, Altunkaynak BZ, BalcK, et al. Effects of high fat diet induced obesity on peripheral nerve regeneration and levels of GAP 43 and TGF-β in rats[J]. Biotech Histochem, 2014, 89(6):446-456.

[12]冷玉芳， 高翊博， 白 洁. 氯胺酮对CCI大鼠背根神经节GAP-43 mRNA表达的影响[J].临床麻醉学杂志, 2010, 26(11):996-998.

(责任编辑： 陈妙玲， 罗 森)

Analgesic effect of angiotensin angiotensin Ⅱ type 2 receptor antagonist EMA401 on neuropathic pain in rats and its mechanism

XIAO Han-yan1, ZHANG Ben-zhuo1, HAN Li-ping2, XU Feng3

(1DepartmentofNeurology,2DepartmentofPediatrics,3DepartmentofGeriatrics,theSecondAffiliatedHospitalofMudanjiangMedicalUniversity,Mudanjiang157011,China.E-mail:xufeng1976@sina.com)

AIM: To explore whether angiotensin Ⅱ type 2 receptor antagonist EMA401 decreases neuropathic pain and the expression of growth-associated protein-43 (GAP-43), protein kinase C (PKC) and calmodulin (CaM) in dorsal root ganglia (DRG) during chronic constriction injury (CCI) in rats. METHODS: SD rats were used to establish CCI model and randomly divided into 4 groups. The rats in model group were given equal volume of normal saline by intragastric administration. The rats in low dose (LD) group were given 5 mg/kg EMA401 by intragastric administration. The rats in middle dose (MD) group were given 10 mg/kg EMA401 by intragastric administration. The rats high dose (HD) group were given 20 mg/kg EMA401 by intragastric administration. The rats in sham operation group received equal volume of normal saline by intragastric administration. Thermal withdrawal latency (TWL) and mechanical withdrawal threshold (MWT) were measured before operation and 7 d, 14 d and 28 d after CCI. After behavioral test, DRG of lumbar spinal was obtained from each group, and was used to determine Ca2+concentration byo-cresolphthalein complexone microplating method, and the expression of GAP-43, PKC and CaM at mRNA and protein levels by Western blotting and RT-PCR. RESULTS: Compared with model group, EMA401 significantly increased the TWL and MWT (P<0.05). Meanwhile, EMA401 significantly reduced Ca2+concentration and the expression of GAP-43, PKC and CaM at mRNA and protein levels in the DRG (P<0.05). CONCLUSION: EMA401 may attenuate neuropathic pain of CCI by inhibiting Ca2+concentration and the expression of GAP-43, PKC and CaM.

EMA401; Neuropathic pain; Growth-associated protein-43; Protein kinase C; Calmodulin

1000- 4718(2017)01- 0110- 06

2016- 08- 02

2016- 09- 28

黑龙江省卫生计生委科研课题(No. JS215H647)

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.01.018

杂志网址： http://www.cjpp.net

△通讯作者 Tel： 0453-8927654； E-mail： xufeng1976@sina.com