浅谈马传染性贫血病琼脂凝胶免疫扩散试验的操作

段新华 廖治锋

（深圳市南山区动物防疫监督所，广东深圳 518052）

浅谈马传染性贫血病琼脂凝胶免疫扩散试验的操作

段新华 廖治锋

（深圳市南山区动物防疫监督所，广东深圳 518052）

马传染性贫血病简称马传贫（EIA），又称沼泽热，是由反转录病毒科马传贫病毒引起的以间歇性发热、贫血、黄疸及出血、进行性消瘦及浮肿为临诊特征的一种马属动物传染性疾病，已分别被世界动物卫生组织和我国农业部列为B类疫病和二类动物疫病。琼脂凝胶免疫扩散试验具有操作简便、特异性强、对设备和技术要求较低、适用于大量血清样本检测等特点，是目前国际贸易中的指定诊断试验方法，也是我国农业行业现行标准（NY/T 569-2002）。现结合笔者多年马传染性贫血检测经验对其试验操作谈几点看法，以供参考。

马传贫 血清样品 琼脂板制备 打孔 加样 结果判定

1 血清样品

试验要求待检马血清应为无沉淀、无浑浊、无溶血的清凉液体，但是，在日常监测中常常会发现有些马血清样本出现溶血或凝固成胶冻状现象，而无法用于检测。出现溶血现象大多是由采血不当造成的，采血人员技术不熟练、马匹不配合等都会造成采血困难、采血量少，造成溶血；另外，存放采好马血的离心管在运输或保存过程中出现摇晃和碰撞也会造成溶血。析出的血清出现凝固，大多与马匹自身因素有关，血脂过高、营养不良、营养过剩及某些疾病都可能造成血清析出困难，因此，采样前尽量减少对马匹的刺激，不要在马匹刚饲喂后或者过度劳累后立即采血。对于溶血的样品，如果溶血不严重，实验时尽量选择清亮部分吸取，建议多做一次重复；如果溶血严重，则需重新采集血样。对于出现果冻状的血清样品，可以在离心时适当增加离心时间和离心转速进行血清分离，如果仍无血清析出，可以用移液器吸头向管壁轻压，通常会有血清出现。

2 琼脂板制备

2.1 琼脂和PBS

琼脂要选用优质纯度高的琼脂粉，因为其中矿物质、金属离子和一些不溶性杂质都会对试验结果造成影响。标准中要求PBS为加入万分之一的硫柳汞的pH7.2的0.01mol/L的磷酸盐缓冲液。硫柳汞主要是用来作为防腐剂和抑菌剂，但是其对人体健康具有一定的毒副作用。笔者通过试验对比发现，无须加入硫柳汞同样能达到好的实验效果。琼脂的浓度建议为1.2%～1.4%，试验发现1%的琼脂会偏稀，不利于打孔，而1.3%左右的琼脂试验效果较佳。琼脂可以用微波炉进行加热，将称好的琼脂粉和相应磷酸缓冲液倒入锥形瓶中，摇匀，用锡纸封口，并用牙签在瓶口扎几个小洞，这样不仅可以减少加热时水分的挥发，同时也能防止琼脂溶液沸腾时锡纸被冲开。琼脂加热时要使其多沸腾几次，这样能更好地除菌和除气。

2.2 倒板

用直径为90mm的玻璃平板或者一次性塑料平板，倒板建议在平整的超净工作台内操作，这样既能保证琼脂表面平坦，又能加快平板冷却，且也能减少空气中细菌的污染。将热琼脂液15～18ml轻轻倒入平板，注意不要产生气泡，如果产生小气泡，可用移液器或一次性吸管将气泡吸出。琼脂板冷却后要及时加盖，防止水分蒸发，并将其翻转放入4℃冰箱过夜。

2.3 打孔

反应孔应采用现用现打、按需打孔的原则，用七孔打孔器进行打孔。打孔最好用放置冰箱过夜后的平板，这样琼脂容易挑出。每块平板建议打2～3组孔，孔组之间要有较宽的间隔，每个组有7孔，中间1孔，外围6孔，每组孔可以检测3个血清样品，试验中根据样品数量确定所需孔组数。打孔时要水平轻轻压下打孔器，不要太用力，以免破坏琼脂板；然后用针头或牙签挑出孔内切下的琼脂，注意挑出时一定不能把琼脂板凝胶挑破，使孔与孔之间出现裂痕，这样会严重影响实验结果。

2.4 封底

由于在打孔挑出孔内琼脂过程中会破坏琼脂板底部的牢固性，甚至出现松动脱离，加样后会导致阳性血清、待检血清和抗原的相互混合，造成实验失败，因此琼脂板在打孔后一定要经过封底处理。试验常采用酒精灯加热的方法进行封底，但这常常造成加热不均，封底效果欠佳，而且，对于塑料平板则更难控制温度。笔者发现，用烧开的沸水进行封底，效果较好。只需将琼脂板放入倒有沸水的器皿中，1min左右取出，冷却即可。注意，当需要封底的琼脂板较多时，要增加沸水量，以保证水温在90℃～100℃之间。

3 加样

琼脂板上每组梅花形7孔中，中间1孔加入抗原，四周孔间隔（按1、3、5）加入标准阳性，其余孔（2、4、6）加入待检血清。加样前要在琼脂板上标记日期和及编号。编号时可以用油性记号笔的细端直接在样品孔对应的平板底面进行标记，只需标记样品序号即可，这样在加样中可以避免样品加错，而且能提高加样操作效率，特别适用于大量样本操作。加样量大概是每孔25μl左右，因为每个平板琼脂孔容量会有不同，建议加样时将移液器调到30μl，然后缓慢加入孔中，当加入液面与琼脂孔周围成水平时停止加样，这样不仅能避免加样时产生气泡，而且能保证每孔能刚好加满。注意加入每个待检血清样品用一个吸头，避免交叉污染，而且加样时不要产生气泡，如果有小气泡可以先吸出气泡，然后再加满孔。样品加完后静置等待5min，使孔中液体吸干，再将平皿倒置放在湿盒内，置于25℃～27℃恒温箱进行反应。

4 结果判定

通常反应6h左右就开始出现沉淀线，12h沉淀线已经比较明显，已经可以进行结果判定。判断结果用时过久沉淀线会逐渐模糊甚至消失，可以在12h、24h做记录，如结果无明显差别，可作最终结果。

总之，每一个环节都有可能影响实验结果的判定，这需要检测工作者根据本实验室具体情况进行操作总结，以制定出适合本实验室的最优检测方案。

[1]盛晓辉.马传贫血病琼脂凝胶免疫扩散试验的方法[J].中国畜禽种业，2014，10（4）：105.