线粒体损伤拮抗剂在Cr(Ⅵ)所致肝细胞凋亡中的保护作用

朱武晖 王曼

线粒体损伤拮抗剂在Cr(Ⅵ)所致肝细胞凋亡中的保护作用

朱武晖 王曼

目的 分析线粒体损伤拮抗剂在六价铬［Cr(Ⅵ)］所致肝细胞凋亡中的保护作用。方法 通过肝细胞培养以及模型的制备获得受试细胞, 分为空白对照组、模型组、低剂量组、中剂量组、高剂量组, 空白对照组：不采用Cr溶液处理传代细胞, 静置24 h。模型组：采用4 μM Cr(Ⅵ)单独处理24 h。低剂量组、中剂量组、高剂量组：分别在4 μM Cr(Ⅵ)溶液处理后, 采用0.5、1.0、1.5 μM 环孢霉素A (CsA)干预。每组试验10次。监测各组细胞存活率、三磷酸腺苷(ATP)、肝细胞凋亡率、Caspase-3活性、通透性转运孔(PTP)开放度、膜电位水平PTP、PTP的ATP、二磷酸腺苷(ADP)、一磷酸腺苷(AMP)、总腺苷酸(TAN)、PTP的ATP/ADP。结果 五组间细胞存活率、ATP、肝细胞凋亡率、Caspase-3活性、PTP开放度、膜电位水平PTP、PTP的ATP、ADP、AMP、TAN、PTP的ATP/ADP比较, 差异均具有统计学意义(P＜0.05), 除ATP、PTP的ATP/ADP外, 其余指标从模型组、低剂量组、中剂量组、高剂量组、空白对照组存在递进关系, 高剂量组与低剂量组间比较差异均具有统计学意义(P＜0.05)。结论 线粒体损伤拮抗剂在Cr(Ⅵ)所致肝细胞凋亡中发挥了保护作用。

铬；肝细胞凋亡；线粒体损伤拮抗剂

国际癌症研究所将铬确认为人类致癌物, 其Cr(Ⅵ)是当前毒性最强、致癌性最强的铬价态, 在细胞凋亡启动中发挥重要作用［1］。理论上线粒体损伤拮抗剂能够拮抗Cr(Ⅵ)所致线粒体损伤作用［2,3］。本次研究采用细胞研究, 分析线粒体损伤拮抗剂在Cr(Ⅵ)所致肝细胞凋亡中的保护作用。

1 材料与方法

1. 1 受试细胞 人胚肝细胞系L-02(L-02肝细胞), 来自上海中科院细胞培养中心。

1. 2 试剂与仪器 主要包括重铬酸钾(基准级, 含量99.99%以上), ATP, 新生牛血清, 二甲基亚砜, 细胞凋亡率监测剂。肝细胞内ATP、ADP、AMP含量检测试剂, 包括ATP、AMP标准品, 四丁基溴化铵、硫酸氢二钾、磷酸二氢钾、磷酸,为分析纯。细胞DNA损伤监测试剂, 正常熔点琼脂糖等。仪器主要包括HH-CP-T型CO2培养箱, 101-1AB型电热鼓风干燥箱, 恒温水浴箱, 酸度计, 自动平衡离心机, DYY-Ⅲ型电泳仪, 倒置显微镜, 酶标仪, 反相高效液相色谱仪等。

1. 3 方法

1. 3. 1 肝细胞培养以及模型的制备 常规细胞培养法获得L-02肝细胞, 10%新鲜牛血清培养RPMI-1640培养基, 5%二氧化碳培养箱中培养, 每隔2～3 d采用0.2% EDTA的0.25%胰酶消化, 传代1次。采用4 μM Cr(Ⅵ)单独处理L-02肝细胞24 h, 加入MTT, 培养板可见紫蓝色结晶, 甲臜裂解液溶液,植被模型成功。

1. 3. 2 分组与试验 空白对照组、模型组、低剂量组、中剂量组、高剂量组, 空白对照组：不采用Cr溶液处理传代细胞, 静置24 h。模型组：采用4 μM Cr(Ⅵ)单独处理24 h。低剂量组、中剂量组、高剂量组：分别在4 μM Cr(Ⅵ)溶液处理后, 采用0.5、1.0、1.5 μM CsA干预。每组试验10次。

1. 4 观察指标 监测的主要内容包括细胞存活率、ATP、肝细胞凋亡率、Caspase-3活性、PTP开放度、膜电位水平PTP、PTP的ATP、ADP、AMP、TAN、PTP的ATP/ADP。

1. 5 统计学方法 采用SPSS20.0统计学软件处理数据。计量资料以均数±标准差()表示, 服从正态分布两两组间比较采用t检验, 多组间比较采用F检验。P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

空白对照组、模型组、低剂量组、中剂量组、高剂量组细胞存活率分别为(0.6780±0.0120)%、(0.5560±0.0150)%、(0.5830±0.0360)%、(0.6110±0.0150)%、(0.6353±0.0340)%, ATP分别为(0.769±0.045)、(0.583±0.025)、(0.573±0.018)、(0.584±0.024)、(0.673±0.053), 肝细胞凋亡率分别为(2.275± 0.011)%、(22.535±0.963)%、(18.461±0.495)%、(17.563± 0.361)%、(14.762±0.438)%, Caspase-3活性分别为(0.436± 0.001)、(0.652±0.032)、(0.631±0.105)、(0.583±0.132)、(0.525± 0.112)×106U/mgpro, PTP开放度分别为(53.204±1.535)、(23.003± 1.433)、(25.634±3.296)、(29.571±4.613)、(35.681±4.312),膜电位水平PTP分别为(40.708±2.143)%、(67.536±0.725)%、(61.540±1.864)%、(55.572±1.209)%、(51.510±1.646)%, PTP的ATP分别为(7.733±0.083)、(2.126±0.028)、(3.170±0.143)、(4.574±0.104)、(5.546±0.086)μg/106cells, ADP分别为(2.127± 0.125)、(0.635±0.043)、(0.725±0.356)、(0.956±0.056)、(1.478± 0.074)μg/106cells, AMP分别为(0.745±0.065)、(0.637±0.026)、(0.674±0.044)、(0.695±0.032)、(0.710±0.048)μg/106cells, TAN分别为(10.576±0.157)、(3.345±0.054)、(3.574±0.086)、(5.466±0.115)、(7.673±0.125)μg/106cells, PTP的ATP/ADP分别为(3.636±0.462)、(3.348±0.325)、(4.372±0.304)、(4.785± 0.298)、(3.752±0.431)。五组间细胞存活率、ATP、肝细胞凋亡率、Caspase-3活性、PTP开放度、膜电位水平PTP、PTP的ATP、ADP、AMP、TAN、PTP的ATP/ADP比较, 差异均具有统计学意义(P＜0.05), 除ATP、PTP的ATP/ADP外,其余指标从模型组、低剂量组、中剂量组、高剂量组、空白对照组存在递进关系, 高剂量组与低剂量组间比较差异均具有统计学意义(P＜0.05)。

3 小结

从本次研究来看, Cr(Ⅵ)确实可能加速肝细胞凋亡, 这可能与其细胞的膜电位水平、PTP开放等作用的调节作用有关［4］。本次低剂量组、中剂量组、高剂量组采用CsA处理后,对象的各项指标更趋近于空白对照组, 各组之间存在递进关系, 提示使用CsA能够对抗Cr(Ⅵ)引起的生物化学改变, 从而减轻肝细胞损伤［5,6］。CsA主要通过保护肝细胞线粒体膜完整性, 维持粒细胞功能等作用, 从而抑制Cr(Ⅵ)诱导肝细胞凋亡［7,8］。

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［3］ Dai Y, Kang X, Yang D, et al. Platinum (Ⅳ) Pro-Drug Conjugated NaYF4:Yb3+/Er3+ Nanoparticles for Targeted Drug Delivery and Up-Conversion Cell Imaging. Advanced Healthcare Materials, 2013, 2(4):562-567.

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Protective effects of mitochondrial damage antagonists on hepatocellular apoptosis induced by Cr (VI)

ZHU Wu-hui, WANG Man. Department of Hepatobiliary Surgery, Qingdao Third People's Hospital, Qingdao 266041, China

Objective To analyze the protective effects of mitochondrial damage antagonists on hepatocellular apoptosis induced by hexavalent chromium ［Cr (Ⅵ)］. Methods The cells were obtained by hepatocyte culture and preparation of the model, and they were divided into blank control group, model group, low-dose group, middle-dose group and high-dose group. The blank control group

no performance of Cr solution for passage cells, and remained for 24 h. The model group received 4 μM Cr (Ⅵ) alone for 24 h. low-dose group, middle-dose group and high-dose group respectively received 0.5, 1.0 and 1.5 μM cyclosporine A(CsA) intervention after process of 4μM Cr (Ⅵ) solution. Each group was tested for 10 times. Monitoring were made on cell survival rate, adenosine triphosphate (ATP), liver cell apoptosis rate, Caspase-3 activity, permeability transition pore (PTP) opening degree, the level of membrane potential PTP, ATP of PTP, adenosine diphosphate of PTP (ADP), adenosine monophosphate (AMP), total adenylate (TAN), ATP/ADP of PTP in groups. Results There were statistically significant difference in cell survival rate, ATP, liver cell apoptosis rate, Caspase-3 activity, PTP opening degree, the level of membrane potential PTP, ATP of PTP, ADP, AMP, TAN and ATP/ADP of PTP (P＜0.05). In addition to ATP, ATP / ADP, the remaining indicators had progressive relationship from the model-group, low-dose group, middle-dose group, high-dose group, blank control group, and there was statistically significant between high-dose group and low-dose group. Conclusion Mitochondrial damage antagonists shows protective effect on hepatocellular apoptosis induced by Cr (Ⅵ).

Chromium; Hepatocellular apoptosis; Mitochondrial damage antagonists

10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2017.15.112

2017-05-12］

266041 青岛市第三人民医院肝胆外科