乳酸菌及酸处理对秸秆生物发酵饲料的化学成分及In vitro甲烷生成的影响

张志登，蒋再慧，韩雅慧，侯建军，房家琛，唐德江，姜宁，张爱忠，李佐同，曹阳

（1.黑龙江八一农垦大学，大庆 163319，2.黑龙江中升牧业有限公司；3.日本弘前大学农学生命科学部）

乳酸菌及酸处理对秸秆生物发酵饲料的化学成分及In vitro甲烷生成的影响

张志登1，蒋再慧1，韩雅慧1，侯建军2，房家琛3，唐德江1，姜宁1，张爱忠1，李佐同1，曹阳1

（1.黑龙江八一农垦大学，大庆 163319，2.黑龙江中升牧业有限公司；3.日本弘前大学农学生命科学部）

采用完全随机（添加处理5×发酵天数2）实验设计，对风干玉米秸秆进行无添加、乳酸菌（LAB）添加、酸液4%、6%和8%添加共计5个处理，发酵30 d和60 d开封。分析了pH、饲料化学成分、微生物组成及In vitro干物质消失率和甲烷生成量。经过发酵30及60 d的pH，LAB、4%、6%和8%的酸添加组均低于对照组，并且在相同添加组中，pH值随发酵时间的增加而显著下降。在饲料化学成分方面，所有添加组的有机物（OM）均高于对照组；LAB添加组的粗蛋白含量（CP）和粗脂肪（EE）均高于其他处理组。在微生物上，30或60 d的5个添加组的乳酸菌、耐热菌、一般细菌及酵母菌分别显著低于对照组；同时在每个处理中，各微生物60 d均低于30日。在In vitro干物质消失率和甲烷生成量方面，所有添加处理组的干物质消失率和甲烷生成量分别高于和低于对照组。以上结果表明，黄贮玉米秸秆的发酵品质60日好于30日，乳酸菌及混合酸处理玉米秸秆，均能提高黄贮玉米秸秆发酵品质，混合酸处理玉米秸秆能够不同程度降解秸秆中的粗纤维为非纤维性碳水化合物，乳酸菌和6%混合酸处理玉米秸秆可以提高In vitro干物质消失率，同时降低甲烷生成量。

玉米秸秆；发酵；干物质；甲烷

我国的第二作物是玉米，其在我国的粮食产业中占据重要位置。近年全国玉米平均年产量为208 120 kt，增产15 340 kt，超过稻谷产量3 830 kt，成为第一大粮食作物品种，也是黑龙江省主要的农作物之一[1]。从而带来大量的玉米秸秆不能有效的利用，绝大部分被焚烧、丢弃，由此对环境造成很大的污染并且造成了资源浪费，这不符合我国当前的环境与发展的思路。玉米是我国粮食生产的主力军，是保障我国粮食安全的主要作物之一，玉米还是重要的加工原料和生物能源物质[2]。玉米含有许多的营养成分，但是就目前而言，其利用率低，被用作饲料的玉米秸秆不足10%[3]。这主要是因为玉米秸秆存在着粗蛋白含量低，NDF含量高，适口性差的问题[4]。正常情况下，一般要求反刍动物饲料CP含量不应低于8%[4]，而玉米秸秆中CP的含量难以达到8%且消化率低，这会造成瘤胃内氨浓度过低，最终影响到瘤胃微生物的增殖和发酵[5]。并且对于动物而言，玉米秸秆作为饲料原料，由于玉米秸秆质地坚硬且适口性差，会降低反刍动物的采食量[6]。因此可以通过物理方法（粉碎，研磨等）、化学方法（加酸等）、生物方法（添加菌等）对其进行处理来改善这些缺点[7]，因此我们对玉米秸秆进行加工处理，再通过发酵来提高玉米秸秆的利用效率。实验将含水量为60%的玉米秸秆作为原料，再添加乳酸菌及不同梯度酸厌氧发酵，对玉米秸秆生物发酵饲料中的营养成分、发酵品质、微生物变化及瘤胃发酵参数进行研究，以探究乳酸菌及不同梯度酸处理在不同发酵阶段对玉米秸秆生物发酵饲料的发酵品质及体外瘤胃消化率的影响，来提高玉米秸秆的利用率，为玉米秸秆类发酵饲料的研发提供一定的理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料及处理

收获籽粒后的玉米秸秆取自黑龙江八一农垦大学农学院实验田。将玉米秸秆粉碎，长度为1～2 cm备用。

采用完全随机5（添加处理）×2（发酵天数）试验设计。将粉碎后的玉米秸秆分别进行无添加、乳酸菌、4%、6%、8%混合酸添加处理，水分调整为60%。混合酸液为2 mol·L-1的硫酸和盐酸，以体积比为4∶1混合。五种处理均装入16×25 cm的包装袋（每个处理6袋），真空密封后，置于室温下发酵。30 d及60 d后，每种处理各开封3袋，供分析检测。

1.2 培养基

预先配制足够的MRS、BLU、NA、DRCA、PDA（需加入20%酒石酸）固体培养基备用，分别用于培养乳酸菌、大肠杆菌、好氧及耐热菌、酪酸菌、霉菌和酵母菌。以上培养基均购自青岛海博生物有限公司。

1.3 玉米秸秆生物发酵品质的分析

1.3.1 玉米秸秆发酵饲料的感官评定

根据青贮质量评定标准[8]的说明，开封后从气味、色泽、质地和有无霉变这四个方面进行感官评定。

1.3.2 开封及滤液的制备

开封后立即从不同处理的真空包装袋中分别取20 g，放入聚乙烯袋内，再加入180 mL蒸馏水，随后，用均质器拍打90 s，再用定性滤纸进行过滤，收集完滤液后，立即测定过滤液的pH值。

1.3.3 化学成分分析

将剩余的样品称重后，在65℃的温度下烘干48小时，然后将所有饲料样品放置于室温下，使其自然回潮24小时得到风干样品。再分别将各个处理样品粉碎（筛子口径为1 mm），待分析一般营养成分。干物质（DM），粗蛋白（CP），粗脂肪（EE）分析是根据（AOAC）[9]中的方法934.01，976.05，920.39进行。酸性洗涤纤维（ADF）和中性洗涤纤维（NDF）的分析方法根据的是Van soest[10]的方法进行的。饲料中的粗蛋白质（CP）根据凯氏定氮法来进行测定的。

1.3.4 微生物培养与细菌形态及计数

通过对原样，开封30 d及60 d的样本原菌液中所含有的乳酸菌（MRS）、大肠杆菌（BLU）、耐热细菌（NA）、好氧菌（NA）、酪酸菌（CLO）、霉菌（PDA）这六种细菌分别进行微生物培养与计数。将原样，30 d和60 d样品的过滤原液一一进行梯度稀释，分别稀释为10倍液、20倍液（使用前需要75℃加热15 min，冷却后使用）、30倍液及50倍液。再分别移取20 μm的稀释菌液，并将菌液涂布于已编号并做好分区的固体培养基平板上的相应位置。再将涂好的BLU、NA、PDA平板置于37℃恒温培养箱中，恒温培养48小时；将涂好的MRS、CLO置于厌氧培养箱中，37℃培养48 h。最后，观察平板上长出的菌落，一一进行区分并计数。而平板上相应区域的总菌数量，可用该区域上所出现的菌落数乘以该区域所涂布菌液的稀释倍数，即可算出原菌液中活菌的含菌数。

1.4 In vitro体外培养

1.4.1 人工唾液

采用McDougll’s缓冲液的配制方法进行配制，1 L人工唾液的组成分别为NaHCO3（9.8 g），KCl（0.57 g），CaCl（0.04 g），NaHPO4·12H2O（9.3 g），NaCl（0.47 g），MgSO4·7H2O（0.12 g），Cysteine hydrochloride（0.25 g），Resazurin（0.001 g）。

1.4.2 瘤胃液的收集

由2头安装永久性瘤胃瘘管的绵羊提供瘤胃液。绵羊饲养于黑龙江八一农垦大学动物科技学院的动物室。上午采食2 h后，通过4头绵羊的瘤胃瘘管进行采集瘤胃液，采集的瘤胃液用4层纱布过滤后，等体积混合，并通入CO2保持厌氧环境。

1.4.3 培养液的制备

人工唾液和瘤胃液以体积比4∶1的比例混合后，通入CO2，并置于39℃水浴锅中备用。

1.4.4 生物饲料培养

称取粉碎（2 mm）的风干样品1 g，分别置于体积为128 mL的培养瓶中，称取50 mL的培养液注入培养瓶内，通入氮气保持厌氧环境，立即盖上胶盖，并用专用封口钳子压紧铝盖，将培养瓶置于恒温震荡水浴锅内，39℃震荡培养48 h。

1.4.5 干物质消失率、pH及甲烷测定

分别对培养后样品的干物质消失率、培养液的pH以及甲烷进行了测定。

1.5 统计分析

实验使用SAS9.0[11]统计软件对玉米秸秆发酵后的化学成分、发酵品质及微生物组成的数据进行统计分析。采用2因素方差分析，并对差异显著项目进行多重比较，采用Tukey法鉴定比较平均数之间的差异显著性（P＜0.05）。

2 结果

2.1 原料化学成分及附着微生物

表1为玉米秸秆原料的一般化学成分及微生物组成。从表中可看出，DM含量为72.24%，OM含量为DM的93.99%，并且ADF及NDF、NFC的含量分别为DM的42.82%及64.46%、15.33%。其中CP和EE的含量分别为DM的3.38%及0.11%。在玉米秸秆原料中发现乳酸菌、酵母菌、一般性细菌、大肠杆菌及耐热菌的数量分别为7.82、5.36、5.36、2.54及4.43。并未检测到霉菌及酪酸菌。

表1 玉米秸秆的化学及微生物组成Table 1 Chemical and microorganism composition of corn straw

2.2 玉米秸秆生物发酵饲料的感官品定

表2为感官评定结果。从表中可看出：无添加组表现为醇香味，黄褐色，质地较硬。4个添加组均表现为酸香味，秸秆原来的黄色，质地较软，无霉变。

2.3 发酵后化学成分

表3为经30、60 d发酵的玉米秸秆生物发酵饲料的化学成分。从表中可看出：所有处理发酵30 d中，在DM含量上，没有差异；在OM含量上，LAB、 4%酸、6%酸和8%酸＞对照；在CP含量上，LAB、8%酸＞对照、4%酸和6%酸；在EE、NFC以及ADF含量上，没有差异（P＞0.05）；在NDF含量上，对照、LAB、4%酸＞6%酸和8%酸。所有处理发酵60 d中，在DM、EE、NFC以及ADF含量上，没有差异（P＞0.05）；在OM含量上，LAB、4%酸、6%酸和8%酸＞对照；在CP含量上，LAB＞对照、6%酸和8%酸＞4%酸；在NDF含量上，6%酸＞对照、LAB和4%酸＞8%酸。通过比较不同发酵天数的化学成分发现，在对照组以及各处理组中30 d的DM含量显著高于60 d（P＜0.05）；除了对照组以外，其他四个处理组30 d的CP含量均显著高于60 d（P＜0.05）；对照、LAB及4%酸的处理组中60 d的NFC含量显著高于30 d（P＜0.05）；在对照、LAB及4%酸的处理组中30 d的ADF含量显著高于60 d（P＜0.05）；在对照、LAB、4%酸及8%酸的处理组中60 d的NDF含量显著低于30 d（P＜0.05）；OM以及EE含量上在不同发酵天数之间没有差异（P＞0.05）。

表2发酵玉米秸秆的感官Table 2 The sensory evaluation of corn straw silage treated by LAB、4%acid、6%acid or 8%acid

表3 发酵30天及60天玉米秸秆生物发酵饲料的化学成分Table 3 Chemical composition of corn straw silage ensiled for 30 d and 60 d

续表3 发酵30 d及60 d玉米秸秆生物发酵饲料的化学成分Continued table 3 Chemical composition of corn straw silage ensiled for 30 d and 60 d

2.4 发酵饲料的pH及水分

表4为经30、60 d发酵的玉米秸秆生物发酵饲料的发酵品质。从表中可看出：总水分及pH的测定上，五个处理发酵30 d生物发酵饲料中，在pH上，对照＞LAB、4%酸、6%酸和8%酸；在总水分含量上没有差异。五个处理发酵60 d的生物发酵饲料中，在pH上，对照＞LAB、4%酸、6%酸和8%酸。通过比较不同天数的发酵品质发现，在对照、LAB、4%酸、6%酸及8%酸处理组中60 d的pH显著低于30 d（P＜0.05）；而在总水分含量上所有处理组的生物发酵饲料在发酵30 d及60 d后均不存在显著差异（P＞0.05）。

表4 发酵30及60 d玉米秸秆生物发酵饲料的发酵品质Table 4 Changes in pH and moisture of corn straw silage ensiled for 30 d and 60 d

2.5 微生物组成及数量

表5为经30及60 d发酵的玉米秸秆生物发酵饲料的微生物组成及数量。从表中可看出：通过比较两个发酵天数五种处理的黄贮的微生物数量发现，相比较于发酵30 d的五个处理组的黄贮，在发酵60 d后，乳酸菌、耐热菌、一般细菌及酵母菌的数量均有所下降，尤其是乳酸菌的数量下降明显。通过比较两个发酵天数的黄贮的微生物数量发现，黄贮发酵30 d后，在乳酸菌的数量上，6%酸＞8%酸＞LAB＞4%酸＞对照；在耐热菌的数量上，LAB＞对照＞6%酸＞8%酸＞4%酸；在一般细菌数量上，4%酸＞8%酸＞6%酸＞对照＞LAB；在酵母菌的数量上，4%酸＞6%酸＞LAB＞对照＞8%酸。而黄贮发酵60 d后，在乳酸菌的数量上，LAB＞8%酸＞4%酸＞6%酸＞对照；在耐热菌的数量上，对照＞8%酸＞4%酸＞6%酸＞LAB；在一般细菌数量上，4%酸＞6%酸＞对照＞8%酸＞LAB；在酵母菌的数量上，对照＞LAB＞4%酸＞8%酸＞6%酸。此外，在五个处理的两个发酵天数中均没有检测到大肠杆菌、霉菌及酪酸菌。

表5 30及60 d玉米秸秆生物发酵饲料的微生物变化Table 5 Change in counts of viable microorganisms（log cfu·g-1FM）of corn straw silage ensiled for 30 d and 60 d

2.6 体外培养发酵品质

表6为经30及60 d发酵，玉米秸秆生物发酵饲料体外培养的瘤胃发酵参数。从表中可看出：五个处理发酵30 d、60 d的玉米秸秆微生物发酵饲料中，在干物质消化率含量上，LAB、4%酸、6%酸、8%酸＞对照。在CH4上，对照＞4%酸、8%酸＞LAB、6%酸；pH值维持在6.58～6.66之间，且不同处理相同发酵天数以及相同处理不同发酵天数之间均无差异（P＞0.05）。CO2含量在345.88 L·kg-1DDM～356.33 L·kg-1DDM之间，且不同处理相同发酵天数以及相同处理不同发酵天数之间均无差异（P＞0.05）。H2S含量在0.34 L·kg-1DDM～0.48 L·kg-1DDM之间。在通过比较每个处理组，不同发酵天数的瘤胃发酵参数发现，所有瘤胃发酵参数均不受到添加处理及发酵天数交互作用的影响，无显著性差异（P＞0.05）。

3 讨论

研究发酵30 d的饲料中对照组及添加处理组的DM含量、pH值均高于发酵60 d的饲料，即随着发酵天数的增加干物质含量及pH值均下降。这是因为饲料含水量降低时，会使细菌繁殖迟缓，青贮作物的细菌总数受到影响，所以青贮的发酵被抑制，反映在青贮中有较高的pH值和较低的乳酸、乙酸等[12]。另外pH下降速度与程度是评定秸秆类发酵饲料是否快速进入发酵状态的关键指标之一，秸秆类发酵饲料的pH在3.9～4.1之间，说明秸秆饲料发酵品质良好[13]。试验发酵30及60 d所有添加处理组的OM含量均高于对照组，即随着发酵时间的延长，pH下降，抑制了有害微生物对有机物的降解，添加酸处理，可以有效地降低半纤维素的含量，使其降解成可溶性糖，半纤维素的降解大大促进了纤维素水解成葡萄糖的产率[14]。从而提高了饲料微生物对有机物的利用率。

表6 30及60 d玉米秸秆生物发酵饲料体外培养的干物质消失率及气体生成量Table 6 Measurements of DM digestibility and gas production in vitro incubation with rumen fluid of corn straw silage

在饲料营养成分中，粗蛋白含量是衡量粗饲料饲用价值的重要指标。发酵30 d添加LAB及8% Acid的两组处理相比较于对照组，粗蛋白含量较高；此外，发酵30 d及60 d的所有添加处理组的粗蛋白含量均高于对照组，主要是由于乳酸菌制剂能够利用饲料中的可溶性糖，转化成为乳酸，使pH值降低，从而抑制了蛋白酶的活性及有害菌（如梭菌）的繁殖，使蛋白质的降解受到抑制，此外，乳酸菌制剂还能够软化纤维，将纤维部分转化成为菌体蛋白[15]。

试验中通过对发酵30 d及60 d的玉米秸秆生物发酵饲料的感官分析，并无霉味、无霉斑以及无腐臭味，初步判断无酪酸菌及霉菌生成，在后续的微生物试验中该结果得到进一步的验证。Cao Y等[18]研究发现，蔬菜渣青贮在发酵3 d之后，LAB的数量迅速提高，并且在四种类型的蔬菜渣中乳酸菌数量达到了108cfu·g-1。在发酵了5 d和7 d之后，乳酸菌数量依然保持着这一水平，并且发酵30 d后，发现乳酸菌数量为106到107。发酵60 d添加LAB处理组乳酸菌含量高于对照及其他处理组，该实验结果与Cao Y[16]所研究的结果一致。另外，通过观察发现乳酸菌添加处理组的乳酸菌数量高于对照组，并且，乳酸菌添加处理组的pH值下降趋势较对照组明显，说明乳酸菌的添加，有效的提高了饲料中乳酸菌的数量，而乳酸菌利用玉米秸秆中的可溶性糖，使得饲料pH值迅速下降，有效的提高了饲料的发酵品质。结果与马迪等[17]所研究结果一致。实验所有添加处理组发酵60 d的饲料与发酵30 d的饲料相比较，一般细菌、酵母菌、耐热菌的数量均呈下降趋势，且pH值维持在3.75～4.18，是由于乳酸菌利用饲料中的营养成分进行生长，产生乳酸使pH值下降使饲料有害菌的数量得到抑制所致。这与蔡义民等[18]研究的结果相似，蔡义民、熊井清雄等[19]在玉米秸秆青贮饲料中添加乳酸菌，对其进行研究，发现添加乳酸菌之后的青贮饲料，有害微生物的繁殖得到有效抑制，发酵品质明显得到改善。另一方面乳酸菌自身在代谢的过程中能够产生多种抑菌物质，这些物质在细菌体内的核糖体中合成具有抑菌活性的多肽类物质，能够对多种细菌产生抑制作用。通过观察发酵30及60 d的玉米秸秆生物发酵饲料的发酵品质发现，总水分含量随发酵时间的增加呈上升趋势，而干物质含量却呈现出下降趋势，这对饲料的瘤胃干物质消化率会产生一定的影响，会导致饲料干物质消化率的下降。

在温室气体中除CO2外，CH4也是温室气体的重要成分之一。在瘤胃微生物发酵中，产甲烷菌利用瘤胃细菌、真菌、原虫降解底物产生甲烷，而瘤胃中的甲烷主要来自于瘤胃中H2与CO2的反应[20]。结果显示，添加处理组在发酵30 d及60 d后，甲烷产气量均低于对照组，这表明乳酸菌及酸添加均能够降低瘤胃甲烷产气量。

4 结论

黄贮玉米秸秆的发酵品质60 d好于30 d，添加LAB、4%、6%和8%混和酸，均能够有效降低pH，对饲料有害菌的生长起到一定的抑制作用，可不同程度降解秸秆中的粗纤维为可溶性碳水化合物，提高干物质消化率。另外，添加LAB及6%混和酸两种处理方式，可以有效的降低瘤胃甲烷产气量。

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Lactic Acid Bacteria and Acid Treatment of Straw Fermentation Feed Effect of Chemical Composition and In vitro Methane Production

Zhang Zhideng1，Jiang Zaihui1，Han Yahui1，Hou Jianjun2，Fang Jiachen3，Tang Dejiang1，Jiang Ning1，Zhang Aizhong1，Li Zuotong1，Cao Yang1
（1.Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319；2.Heilongjiang Zhongsheng Husbandry Co.Ltd.；
3.Faculty of Agriculture and Life Science，Hirosaki University，Japan）

A completely randomized design with a 5×2[additive treatment（5）×fermentation day（2）]factorial treatment structure was used in this study，the experiment treatment included corn stover silage without or with lactic acid bacteria（LAB），4%，6%and 8% mixed acid，and the silage was opened on the 30 or 60 day of fermentation.The pH value，chemical composition，microbiological composition，in vitro rumen digestibility of dry matter（DDM）and methane production of corn stover silage were determined to study the effects of biological fermentation corn stover treated with LAB or acid on chemical composition and ruminal DDM and methane production in vitro.The pH value in LAB，4%，6%and 8%groups were lower than that in the control，and with fermentation day extending，pH decreased.The OM or NDF in the all addition groups was higher or lower than that in the control，and the CP and EE in LAB group were the highest.The LAB，bacilli bacteria，aerobic bacteria and yeasts in the all addition groups were lower than those in the control on the 30th or 60th day of fermentation，and the microorganism’s number on the 60th day was lower than that on the 30th day.In vitro DDM and methane production for all addition groups were higher，or lower than those for the control，respectively. The results suggested that the quality of the yellow corn silage on the 60th day was better than silage on the 30th day，adding both LAB and mixed acid could get good quality silage，and adding mixed acid could degrade NDF into non-fibrous carbohydrate，and either LAB or 6%mixed acid could increase in vitro DDM but decrease methane production of yellow corn stover silage.

corn straw；fermentation；dry matter；methane

S816.32

A

1002-2090（2016）06-0008-08

10.3969/j.issn.1002-2090.2016.06.002

2015-06-26

国家科技支撑计划课题（2013BAD21B01）；黑龙江八一农垦大学引进人才科研启动计划（XYB2013-11）；中央引导地方科技发展专项（ZY16A06）。

张志登（1991-），男，黑龙江八一农垦大学动物科技学院动物科学专业2013级本科生。

曹阳，教授，硕士研究生导师，E-mail：hbdkcaoyang@136.com。