衍生气相色谱法测定渔用预混料中肌醇的含量

■吴 凌

(福建省产品质量检验研究院，福建福州350002)

肌醇学名环己六醇，是水溶性B族维生素的一种，作为维持水生动物正常生理功能必需的营养素之一,被广泛应用于水生动物饲料中。当饲料中肌醇含量过低时会影响水产动物的正常生长,易造成水产动物生长缓慢、厌食、皮肤易受损伤等症状[1-2]。研究表明，饲料中适量添加肌醇可提高哲罗鲑、黑鲷、草鱼和虾类等水产动物的食欲，提高饲料利用效率，促进肝脏和其它组织中脂肪的代谢，提高动物的成活率和消化酶活性及生长性能，提高免疫力[3-5]；与此同时，由于肌醇价格较高，与葡萄糖外形相似，故常有掺假情况发生[6]。因此，如何准确测定水产饲料中肌醇的含量是饲料生产过程中面临的重要问题之一。

目前，肌醇常用的检测方法有微生物法、液相色谱法、液相色谱串联质谱法和气相色谱串联质谱法、气相色谱法等[7-13]。由于饲料成分的特殊性和复杂性，微生物法不适用于饲料中的肌醇检测，液相色谱法对色谱柱要求严格且检测限较高，液质法、气质法由于所需仪器价格高，难以大面积推广使用，而气相色谱法操作简单，重复性好，适合于饲料中的肌醇检测。本文建立了衍生气相色谱法测定渔用饲料中肌醇的含量的方法，并用该方法对某些渔用饲料中的肌醇含量进行了考察，能满足大批量样品的检测需求，为准确评价水产饲料中的营养成分提供参考。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Agilent 6890A气相色谱仪（配FID检测器，自动进样器和化学工作站）、BT224S天平(德国Sartorius公司)、石英毛细管柱ZB-5（美国Phenomenex公司）、HH-6型数显恒温水浴锅(江苏康健医疗用品有限公司)、H2050R台式高速冷冻离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）、KQ-800KDE型功率数控超声波清洗器(常州诺基仪器有限公司)、EZ-2溶剂蒸发仪（英国Genevac公司）、XW-80A涡旋混匀器(上海习仁科学仪器有限公司)。

试剂：肌醇标准品(德国Dr公司，纯度≥99.2%)、N,N-二甲基甲酰胺、三甲基氯硅烷、六甲基二硅胺烷、异辛烷(均为色谱纯试剂，购自国药集团化学试剂有限公司)，试验用水符合GB/T 6682—2008中二级用水规定。

1.2 气相色谱条件

色谱柱：ZB-5（30 m×0.32 mm×0.25 μm），柱箱温度：100℃，保持1 min，以10℃/min速率升到220℃，保持6 min；检测器温度：300℃；进样口温度：270℃；载气：氮气（纯度不小于99.999%）；辅助气：氢气（纯度不小于99.99%），空气（压缩空气）；气体流量：柱流量2.50 ml/min，氢气30 ml/min，空气400 ml/min，尾吹气30 ml/min；进样量：1 μl；分流比：5∶1。在此色谱条件下，典型的色谱图见图1。

1.3 操作步骤

1.3.1 标准储备液配制

精确称取已在105℃条件下烘至恒重的肌醇标准品0.10 g（精确至0.000 1 g），用去离子水溶解，并稀释定容至100 ml，该储备液为1 000 μg/ml。

1.3.2 标准工作液配制

分别移取标准储备液0.25、1.00、2.00、4.00、6.00、8.00、10.0 ml置于6个100 ml容量瓶中，用去离子水定容，摇匀备用，配制成浓度为2.50、10.0、20.0、40.0、60.0、80.0、100.0 μg/ml的肌醇标准工作液。

1.3.3 衍生剂配制

将三甲基氯硅烷、六甲基二硅胺烷、N,N-二甲基甲酰胺按体积比1∶2∶8混合均匀,装于细口瓶中密封，现配现用。

增大截面法是结合植筋增大受力构件截面面积，从而增大截面惯性矩，缓和应力梯度、提高抗弯刚度、增强抗震性能，具有概念清晰、施工快速、中断交通时间短等优点，因而常用于钢筋混凝土梁柱结构加固。目前加固设计多采用手算，存在控制截面关键参数验算繁杂，存在位移、内力、应力、破坏区极值、范围随加固方案变化等诸多问题，本文研究了加固设计简化计算方法，以期提高工程加固设计效率。

1.3.4 试样溶液制备

提取：称取已粉碎好的饲料样品2 g（精确至0.000 1 g），置于100 ml容量瓶中，加水约70 ml，然后超声20 min，冷却至室温，用水定容、摇匀，取10 ml转移至20 ml离心管，4 000 r/min离心5 min，吸取1 ml溶液于20 ml顶空瓶中，于溶剂蒸发仪中真空浓缩至干。

衍生化：在浓缩至干的样品中加入1 ml上述配制好的衍生剂，涡旋1 min，封盖，80℃水浴反应20 min，取出，冷却至室温；加入5 ml去离子水和3 ml异辛烷，涡旋1 min后静置分层，吸取上层异辛烷层，加入少量无水硫酸钠，振摇后，取适量上清液上机测定。

1.3.5 测定

在上述选定的色谱条件下，待仪器稳定后，进行标准溶液和试样溶液气相色谱分析。

2 结果与讨论

2.1 系统适用性

分别取空白基质样品、标准品和渔用预混料样品按上述前处理方法制备的溶液，按所述色谱条件测定。测定结果表明，空白基质样品在肌醇保留时间处无杂质峰干扰(见图1A)，表明样品中其他成分不干扰测定，方法特异性强，适用于渔用预混料中肌醇含量测定。

2.2 线性关系考察

将肌醇标准系列溶液在上述的气相色谱条件下进样分析，以标准溶液浓度为横坐标，对应的峰面积为纵坐标，拟合标准曲线，回归方程为Y=1.065 2X+0.362 91，相关系数r=0.999 8；结果表明，肌醇浓度在2.50～100.0 μg/ml范围内呈良好的线性关系。

2.3 重现性试验

取同一样品6份，按上述的前处理方法制备供试品溶液，按前述方法测定含量，结果见表1，6份样品含量平行测定结果的相对标准偏差RSD为2.3%，试验结果表明方法重现性好。

表1 重现性试验结果

2.4 回收率试验

在2 g空白样品基质中加入一定量的肌醇标准品进行回收率试验，用上述试样制备方法提取、衍生、萃取后，进行GC分析检测，结果表明方法回收率理想，不同加标水平的回收率在93.4%～102.7%之间，具体结果见表2。

表2 加标回收试验结果

2.5 溶液稳定性试验

按1.3.4中的前处理方法制备样品溶液，按1.2中仪器条件方法测定肌醇含量，样品溶液密封保存在冰箱冷藏环境中，隔4、8、24、48 h测定含量，结果见表3，表明样品溶液在48 h内稳定。

表3 样品溶液稳定性试验结果

2.6 实际样品测定

对3个渔用预混料试样品，分别精确称样后，用上述试样制备方法提取、衍生后，上GC分析。渔用预混料中肌醇含量测定结果如表4所示，测定结果与理论值相符。

表4 渔用预混料中肌醇含量测定结果

2.7 谱图

空白样品基质谱图见图1A，肌醇标准对照品见图1B，空白样品基质加肌醇标样见图1C，渔用预混料样品见图1D。

2.8 色谱柱选择

渔用预混料成分较为复杂，一般由鱼粉、麦麸、豆粕、矿物盐等多种成分组成，要得到良好的分离效果，色谱柱的选择极为重要。本文考察了3种不同极性的色谱柱，ZB-5、DB-35及ZB-WAX毛细管色谱柱，综合考虑分离效果、峰形、样品基质中其他组分出峰情况以及整体分析时间，ZB-5毛细管色谱柱效果最好，因此以ZB-5毛细管色谱柱作为本研究试验用色谱柱。

2.9 柱温优化确定

柱温是气相色谱分离的重要参数，在色谱条件的摸索过程中，曾参照有关文献[8-11]，考虑到渔用预混料中组分较多，组分间性质、沸点差异大，采用等温检测时各组分间分离不理想，故采用程序升温法。比较60、100、120、150℃等初温和多种程序升温速率，在满足系统适应性试验要求下,尽可能避免组分残留和缩短分析时间；通过试验摸索出最优升温程序，即100℃保持1 min后以10℃/min速率升到220℃并保持6 min，此条件下样品中的肌醇成分与其他组分完全分离，满足分离要求。

2.10 提取溶剂的选择

根据文献，肌醇易溶于水，在25℃时水中溶解度为14 g/100 ml，且相关肌醇含量测定的多数文献也采用水为提取溶剂，水与其他溶剂相比无毒，价格便宜，所以选择水作为提取溶剂，试验证明结果良好。

2.11 除水步骤的控制

本试验衍生反应是通过硅烷化试剂的硅烷化作用将硅氧基引入肌醇分子中，取代其结构中的六个活性氢键，从而降低其极性，增强其挥发性同时提高其热稳定性；也正因为硅烷化试剂对活泼氢敏感，可与其发生反应，所以硅烷化试剂同样对水非常敏感，在有水的环境中会自行分解失效，从而影响衍生效率。由于水的沸点较高，采用传统的水浴蒸除法和旋转浓缩法去除，不易去除完全，如果试验人员的经验不足，容易导致衍生不完全，重现性差、结果偏低；本试验采用EZ-2型自动平行溶剂蒸发仪，通过控制真空度、红外加热温度、蒸发时间等参数可以较好地达到去除水分的目的，重现性好且效率高。

2.12 硅烷化条件的优化确定

2.12.1 衍生温度的选择

肌醇的衍生化反应需要在一定的温度下进行，因此温度高低决定其衍生反应是否能够进行完全。选择加标量为5 000 mg/kg的空白预混料样品作为试验对象，对不同衍生温度60、65、70、75、80、85、90 ℃进行考察，以肌醇衍生物的峰面积大小作为评价衍生效果的参数。由试验结果得知，目标化合物的峰面积随温度升高逐渐变大，到80℃后开始逐渐减小，原因是在大于80℃时，肌醇才能与硅烷化试剂结合生成结构稳定的六(三甲硅氧基)环己烷，硅烷化反应完全，但是水浴温度过高时，生成的产物由于水浴温度太高而易挥发，导致其测定值降低。故本试验选择80℃作为肌醇衍生反应的最优水浴温度。

2.12.2 衍生时间的选择

以加标量为5 000 mg/kg的空白预混料样品作为试验对象，在80 ℃条件下对10、15、20、25、30 min和35 min的衍生时间对硅烷化反应的影响进行了考察。结果显示，从20 min开始随着衍生时间的增加，衍生物的峰面积不再明显增加，表明该反应在20 min时已反应完全。故本试验选择衍生时间20 min为最优衍生时间。

3 结论

本文通过大量试验对渔用饲料中肌醇的测定进行了探索，最终选择出最适用于渔用饲料样品的前处理条件，并采取衍生气相色谱法对肌醇进行测定，且通过平行测定、加标回收以及对已知添加值的实际样品的测定等手段对该方法的准确性和精密度进行了考察。试验结果表明,由于方法选用得当，检测结果能真实反映渔用饲料样品中肌醇的含量。与传统国标方法相比，该方法操作简便、重复性好，同时可以满足实际检测工作中大批量样品检测的需求，是一种更为准确、高效的分析方法。另外，本文通过对渔用饲料样品肌醇的定量分析，为渔用预混料的质量控制提供科学依据，为准确评价水产饲料中的营养成分提供了有力的参考。