蛹虫草菌固体发酵产α-半乳糖苷酶的优化

■ 邓永平 刘晓兰* 鲁 颂 波丽特 郭建华 艾瑞波

(1.齐齐哈尔大学食品学院，黑龙江齐齐哈尔161006；2.黑龙江省普通高校农产品深加工重点实验室，黑龙江齐齐哈尔161006；3.齐齐哈尔大学理学院，黑龙江齐齐哈尔161006）

α-半乳糖苷酶（α-D-galactoside galactohydro⁃lase，EC 3.2.1.22）是一种外切糖苷酶，可专一性地催化α-半乳糖苷键的水解，棉籽糖、水苏糖、蜜二糖、毛蕊花糖以及刺槐豆、瓜尔胶等多糖均可作为其底物[1-4]。α-半乳糖苷酶在食品、饲料和医药等领域有重要应用，如用于降解大豆产品中存在的不可消化的低聚糖，可有效改善机体因缺乏该酶引起的肠胃不适、胀气等食物不耐受问题[5-7]；用于除去甜菜和糖浆中棉籽糖以及转糖基[8-9]；可有效降解饲料中存在的半乳糖苷等抗营养因子，提高饲料的利用率，增加动物采食量[10]；可用于治疗法布里病[11]。因此，α-半乳糖苷酶成为目前的研究热点。

研究人员对多种微生物来源的α-半乳糖苷酶的发酵条件和酶学性质进行了研究，如米根霉变种（Rhizopus oryzae strain）SUK、嗜酸乳杆菌（Lactobacil⁃lus acidophilus）、篮 状 菌（Talaromyces leycettanus）JCM12802、米赫根毛霉菌（Rhizomucor miehei）等菌株经固体发酵或液体发酵均可产α-半乳糖苷酶[12-15]。固体发酵（SSF）生产设备简单，水分含量低，不易污染杂菌，还可以使用廉价的农业工业废物作为底物，由于使用较少的溶剂萃取产物，所以产物浓度较高，纯化过程成本较低，是生产酶的重要技术[16]。

蛹虫草(Cordyceps militaris)又名北冬虫夏草，是虫草属的模式种，与中华冬虫夏草同属于真菌门(Eu⁃mycota)、子囊菌亚门(Ascomycotina)、核菌纲(Pyrenomy⁃cetes)、球壳目(Sphaeriales)、麦角菌科(Clavicipitaceae)、虫草属(Cordyceps)[17]。蛹虫草在我国的黑龙江、吉林、辽宁等省份均有野生分布，是名贵的食药兼用大型真菌，具有抗氧化、抗衰老、抗肿瘤等多种生理活性[18-20]。蛹虫草经发酵可产多种生物活性成分，但到目前为止，未见有蛹虫草发酵产α-半乳糖苷酶的报道。

在前期研究中，我们发现在蛹虫草菌固体发酵产物中含有α-半乳糖苷酶活力。本文对蛹虫草菌固体发酵工农业废物产α-半乳糖苷酶的培养条件进行了探索，以期为来源安全菌株的α-半乳糖苷酶的生产提供新思路，为利用工农业废弃物产高附加值产物提供新途径。

1 材料与方法

1.1 菌种

蛹虫草菌(Cordyceps militaris)，CGMCC No.1836。

1.2 试剂和仪器

pNPG购自Sigma公司；其它试剂均为国产分析纯试剂。CF15RXII高速冷冻离心机(Hitachi)；高速万能粉碎机FW80(天津市泰斯特仪器有限公司)；分光光度计TU-1810(北京普析通用仪器有限公司)。

1.3 试验方法

1.3.1 培养基

改良PDA培养基（%）[21]：葡萄糖1、蛋白胨0.5、马铃薯汁20、磷酸二氢钾0.1、硫酸镁0.05、琼脂2.0，pH值自然。

种子培养基（%）：葡萄糖2、蛋白胨0.5、马铃薯汁20、磷酸二氢钾0.1、硫酸镁0.05，pH值自然。

固体发酵培养基：在250 ml三角瓶中装入12 g物料，物料种类及物料配比根据试验确定。

1.3.2 培养方法

将蛹虫草菌株挑取至改良PDA斜面上，在23℃培养7 d后，挑取斜面培养物，接入改良PDA平板中，在23℃培养15 d，用无菌打孔器在生长良好的平板培养物上取出1.5 cm的菌块，接种到装有100 ml种子培养基的250 ml三角瓶中，23℃振荡培养5 d，摇床转速180 r/min。将液体种子接入固体发酵培养基中，在23℃培养一定时间。

1.3.3 粗酶液的制备

培养结束后，向固体发酵培养物中加入100 ml生理盐水，在180 r/min浸提酶2 h。浸提结束后，过滤除滤渣，在4℃、10 000 r/min离心10 min，得到粗酶液。

1.3.4 酶活力的测定

采用pNPG比色法，参考莫海飞等[22]进行。

酶活力定义：在37℃条件下，每分钟分解底物生成1.0 μg硝基酚所需酶量为一个酶活力单位，用U/g表示。

1.3.5 碳、氮源对α-半乳糖苷酶活力的影响

以麸皮为碳源，分别以花生粕、豆粕、棉籽粕、菜籽粕和豆饼粉作为氮源，碳、氮源比例为2∶1，培养基含水量为1∶1，接种后于23℃培养72 h，通过测定酶活力确定合适的氮源；以菜籽粕为氮源，分别以燕麦、玉米皮、稻壳、麸皮为碳源，碳、氮源比例为2∶1，培养基含水量为1∶1，接种后于23℃培养72 h，通过测定酶活力确定合适的碳源；调节麸皮与菜籽粕比例为6∶1、5∶1、4∶1、3∶1和2∶1，培养基含水量为1∶1，接种后于23℃培养72 h，通过测定酶活力确定合适的碳氮源比例。

1.3.6 诱导物对α-半乳糖苷酶活力的影响

以瓜尔豆胶、刺槐豆胶、棉籽糖、水苏糖和乳糖为待选诱导物，以麸皮和菜籽粕为原料，物料比为3∶1，培养基含水量为1∶1，待选诱导物的加量为1%，接种后于23℃培养72 h，通过测定酶活力确定合适的诱导物。

1.3.7 培养条件对α-半乳糖苷酶活力的影响

以α-半乳糖苷酶的活力为指标，通过单因素试验对影响蛹虫草菌固体发酵产α-半乳糖苷酶的培养条件进行了优化，包括培养基初始pH值（以0.1 mol/l的HCl或NaOH溶液调节培养基的初始pH值分别为4、5、6、7、8、9）、含水量（调节培养基含水量分别为1∶0.4、1∶0.6、1∶0.8、1∶1和1∶1.2）和培养时间（72、84、96、108 h和120 h），并且在后续的试验中使用最佳条件，平行试验三次。

2 结果与讨论

2.1 碳、氮源对α-半乳糖苷酶活力的影响

2.1.1 氮源对α-半乳糖苷酶活力的影响

水苏糖和棉籽糖对黑曲霉（Aspergillus nige）zju-Y1、罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri）产α-半乳糖苷酶均有诱导作用[23-24]。选择含水苏糖和棉籽糖量较高的氮源，如花生粕、豆粕、棉籽粕、菜籽粕和豆饼粉作为蛹虫草固态发酵产α-半乳糖苷酶的培养基氮源。考虑到蛹虫草是严格好氧菌，故选择疏松、保水能力较强并能提供碳水化合物、蛋白质和多种微量元素的麸皮作为碳源。产α-半乳糖苷酶情况如图1所示。

图1 氮源对α-半乳糖苷酶活力的影响

由图1可知，当以菜籽粕为培养基主料时，菌株产α-半乳糖苷酶的活力明显高于其他几种物料。菜籽粕中水苏糖与棉籽糖含量明显高于其他几种物料，其比例接近1∶1，蛹虫草产生的α-半乳糖苷酶能分解多糖生成α-连接的末端非还原性的D-半乳糖，提供生命活动所需的能量，可能对产酶有较好诱导作用。

2.1.2 碳源对α-半乳糖苷酶活力的影响

以菜籽粕为氮源，分别以燕麦、玉米皮、稻壳、麸皮为碳源，试验条件同上，确定碳源对蛹虫草固体发酵产α-半乳糖苷酶的影响。结果见图2。

图2 碳源对α-半乳糖苷酶活力的影响

如图2所示，当麸皮为碳源时，蛹虫草固体发酵产α-半乳糖苷酶的效果最好，与燕麦及玉米皮相比，麸皮赋予培养基更大疏松度，有利于蛹虫草菌株长时间好氧发酵，故选用麸皮做为碳源。

2.1.3 碳、氮源比例对α-半乳糖苷酶活力的影响

微生物固体发酵培养基中碳源和氮源的比例对于目标物质的生产特别重要，如果氮源过多，则菌体生长过于旺盛，不利于代谢产物积累，氮源不足则菌体生长过慢。碳源不足，容易引起菌体衰老和自溶。因此，需要对麸皮与菜籽粕的比例进行优化。试验结果见图3。

图3 碳、氮源比例对α-半乳糖苷酶活力的影响

麸皮使培养基结构疏松，给发酵提供了所需的气体交换空间，有利于好氧菌蛹虫草菌呼吸产能，菜籽粕富含蛋白质，为酶的合成提供原料，如图3所示，当麸皮与菜籽粕比例为3∶1时，产酶活力最高。

2.2 诱导物对α-半乳糖苷酶活力的影响

α-半乳糖苷酶是一种诱导酶，在培养基中添加酶的底物可以提高酶的表达量[24]。除了棉籽糖、水苏糖外，短链的α-半乳糖苷类化合物对α-半乳糖苷酶的诱导也有一定效果。瓜尔豆胶、刺槐豆胶均为一种由配糖键结合的半乳甘露聚糖组成的高分子量水解胶体多糖，含有α-半乳糖苷酶水解位点α-半乳糖苷键。选择瓜尔豆胶、刺槐豆胶、棉籽糖、水苏糖和乳糖为诱导物进行试验。试验结果见图4。

图4 诱导物对α-半乳糖苷酶活力的影响

如图4所示，与无诱导物的对照组相比，添加诱导物使菌株产酶活力提高，其中添加刺槐豆胶时菌株产酶活力明显高于其他几种物质，瓜尔豆胶的诱导效果仅次于刺槐豆胶，这与黑曲霉菌（Aspergillus nige）zju-Y1产α-半乳糖苷酶的诱导物一致[23]。根据试验结果选择刺槐豆胶作为蛹虫草固体发酵产α-半乳糖苷酶的诱导物。

2.3 培养条件对α-半乳糖苷酶活力的影响

2.3.1 培养基含水量确定

培养基含水量影响微生物对营养物质利用及代谢产物的生成，进而影响到微生物的生长状态和产酶量。水分太少不利于菌丝生长，水分过多导致通气减弱。培养基含水量对产酶的影响结果见图5。

如图5所示，当培养基料水比为1∶1时，α-半乳糖苷酶酶活力最高，当培养基料水比大于1∶1时，微生物代谢速率下降，影响产酶；当培养基料水比小于1∶1时，水分比例高，空气的流通性减弱，对于好氧性的蛹虫草菌来说氧气不足，生长受抑制，产α-半乳糖苷酶效率也有所下降，尤其在料水比1∶0.4时，培养物中完全检测不到酶活力。因此，确定蛹虫草菌株固体发酵产α-半乳糖苷酶的培养基料水比为1∶1。

2.3.2 培养基初始pH值的确定

培养基初始pH值影响微生物原生质膜所带的电荷以及某些营养物质的分解和电离程度，从而影响微生物对营养物质的吸收。培养基初始pH值对蛹虫草固体发酵产α-半乳糖苷酶活力的影响结果见图6。

图6 培养基初始pH值对α-半乳糖苷酶活力的影响

如图6所示，培养基最适初始pH值为6时适合蛹虫草菌株产α-半乳糖苷酶，当pH值小于或大于6时，酶活力随着pH值改变呈下降的趋势。确定蛹虫草固体发酵产α-半乳糖苷酶的培养基初始pH值为6。

2.3.3 培养时间的确定

以麸皮和菜籽粕为原料，物料比为3∶1，诱导物为刺槐豆胶，培养基含水量为1∶1，培养时间分别设定为72、84、96、108 h和120 h，于23 ℃培养，考察培养时间对蛹虫草固体发酵产α-半乳糖苷酶的影响，试验结果见图7。

图7 培养时间对蛹虫草固体发酵产α-半乳糖苷酶的影响

如图7所示，培养时间对蛹虫草产α-半乳糖苷酶的活力有显著的影响，培养96 h时产酶活力较高，继续培养，酶活力逐渐下降，原因可能是培养基中可供蛹虫草菌利用的营养物质逐渐消耗，供氧不足，微生物生长进入衰退期，故选择96 h为最佳发酵时间。

3 结论

α-半乳糖苷酶在食品、饲料和医药领域有重要应用。本文利用药食兼用的大型真菌蛹虫草菌固体发酵生产α-半乳糖苷酶，通过单因素试验优化了产酶条件。固体发酵培养基由麸皮和菜籽粕组成，物料比为3∶1，诱导物为1%的刺槐豆胶，培养基初始pH值为6，含水量为1∶1，在23℃培养96 h，优化条件下产酶活力为5.03 U/g，较优化前产酶活力1.23 U/g提高了约4倍。